布鲁氏菌omp31蛋白B细胞表位及其单克隆抗体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了布鲁氏菌omp31蛋白B细胞表位及其抗体和应用，表位的序列为EYLYTDLGKRNLVDVD。本发明还公开了识别上述表位的单克隆抗体，及上述表位与单克隆抗体的应用，都有助于布鲁氏菌病的诊断。
【专利说明】布鲁氏菌omp31蛋白B细胞表位及其单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种布鲁氏菌〇mp31蛋白B细胞表位，以及使用该表位刺激得到的抗 布鲁氏菌omp31蛋白单克隆抗体。本发明还涉及该细胞表位抗体及该细胞表位的应用。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌病（Brucellosis)是目前世界上流行最广的人畜共患传染病之一，据世 界卫生组织统计表明，全世界每年出现50万例人布鲁氏菌病，每年造成的经济损失达30亿 美元。我国布病的流行以羊种布氏杆菌为主的混合感染，羊种占流行株的80%。
[0003] 布鲁氏菌病临床症状复杂，引起的发热、流产等病理损害易与某些常见疾病混淆； 医生很难单凭有无病畜接触史来诊断布氏菌感染，给诊断带来了一定的困难，容易导致误 诊，造成慢性感染。另一方面缺乏有效的治疗手段，抗生素的大量长期使用仍很难见效，且 容易引起耐药性问题。因此，布鲁氏菌的疫苗预防和早期快速诊断对布菌的防控具有重大 的现实意义；其中疫苗的免疫效果和布菌诊断的准确性就显得尤为重要。目前，布鲁氏菌病 的免疫制剂种类主要包括弱毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、抗独特性疫苗和DNA疫苗 等。
[0004] 由于热灭活菌缺乏活性抗原刺激，不能在体内诱发可检测的IL-12,并且抑制 IL-12的产生，免疫效果不佳，而且死菌诱发的多是无保护力的体液免疫应答。而亚单位疫 苗虽然可起到短期的保护作用，但并不能诱发有效的长期免疫，只有活菌才能诱发细胞免 疫。
[0005] 我国主要是以布鲁氏菌弱毒菌苗株M5-90来免疫羊。它对成年羊有很好的免疫保 护效果，但会导致妊娠羊流产。〇mp31蛋白为膜孔蛋白，与弱毒菌苗株毒力相关，并含有保护 性抗原表位，其基因序列在不同的种属之间的同源性高达98%以上，在牛种菌中缺失，在羊 种和猪种之间存在大约9个核苷酸的差异，并存在氨基酸序列的改变，故omp31蛋白的单克 隆抗体可能能够鉴别诊断不同生物型的布鲁氏菌感染。若将M5-90疫苗株携带的omp31基 因全部敲除，则影响弱毒菌苗株的免疫效果。另外，由于M5-90免疫的动物和野毒菌株自然 感染的动物现有诊断方法不能鉴别，严重影响了布鲁氏菌病的检验和疫苗免疫预防。因此， 针对omp31蛋白的抗原表位进行修饰或改造标记疫苗，可建立该表位多肽ELISA诊断方法 及其诊断试剂，进而解决布鲁氏菌病鉴别诊断和基因工程标记弱毒菌苗株的技术难题。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种布鲁氏菌omp31蛋白B细胞表位。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供上述omp31蛋白B细胞表位在制备布鲁氏菌病诊断 试剂中的应用。
[0008] 本发明的又一个目的在于提供由上述表位刺激产生的单克隆抗体。
[0009] 本发明的再一个目的在于提供上述单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌 病试剂或药物中的应用。
[0010] 本发明所采取的技术方案是： 布鲁氏菌〇mp31蛋白B细胞表位，其序列为EYLYTDLGKRNLVDVD ( SEQ ID N0:24)。
[0011] 一种抗布鲁氏菌〇mp31蛋白单克隆抗体，其制备方法为： 1) 将上述的布鲁氏菌〇mp31蛋白B细胞表位免疫动物； 2) 取经免疫的动物脾细胞与瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗布鲁氏菌omp31蛋白的杂 交瘤细胞； 3) 收集、纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，即为抗布鲁氏菌omp31蛋白的单克隆抗 体。
[0012] 作为优选的，所述单克隆抗体的重链为IgG2a、轻链为K链，该单克隆抗体能与上 述的布鲁氏菌〇mp31蛋白B细胞表位特异性结合。
[0013] 作为优选的，产生免疫反应的动物的血清间接ELISA效价不低于1 :51200。
[0014] 本发明的有益效果是： 本发明的布鲁氏菌〇mp31蛋白B细胞表位，偶联之后可用于检测羊血清中的布鲁氏菌 病，建立P印tide-ELISA检测方法，为新型分子标记疫苗的研制提供依据。本发明的单克隆 抗体，对omp31蛋白具有很好的特异性识别能力，可以精确地识别布鲁氏菌的表位。本发明 的单克隆抗体及〇mp31蛋白B细胞表位可用于制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病的试剂或 药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是PCR扩增目的序列的电泳图； 图2是omp31重组蛋白表达电泳鉴定图； 图3是omp31重组蛋白纯化电泳鉴定及Western-Blot血清鉴定图； 图4是Western-Blot试验检测单克隆抗体omp31-5B3与布鲁氏菌疫苗株M5-90中提 取的天然膜蛋白的反应性结果图； 图5是多肽-ELISA测定单克隆抗体株omp31-5B3抗原表位结果图； 图6是间接免疫荧光试验检测单克隆抗体omp31-5B3与感染带有omp31基因的慢病毒 的293FT细胞反应性结果图； 图7是酶免疫染色试验检测单克隆抗体omp31-5B3与羊种布鲁氏菌菌涂片反应性结果 图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0017] 本发明使用的布鲁氏菌M5-90疫苗株购自兰州兽医研究所，为本行业所公知的疫 苗株。
[0018] -、omp31重组蛋白表达载体的构建 以新疆石河子大学陈创夫教授提供的布菌基因组为模板扩增目的基因序列，利用 GenBank 中提供的羊布鲁氏菌omp31 基因序列，GenBank accession No. gi|333601402,用 生物学软件〇lig〇7设计引物扩增截短N端19个氨基酸信号肽的omp31基因，选用PET-30a 载体，分别在5'端和3'端引入Nde I及Xho I酶切位点，斜体加粗为酶切位点。
[0019] 上游引物 F : 5-GGAATTra7?7^GCCGACGTGGTTG-3 (SEQ ID NO: 28 ) 下游引物R:5-CCG?77ΓG^GAACTTGTAGTTCAGAC-3(SEQIDN0:29) PCR 扩增目的基因：25 μ L 体系包括 dNTP 1. 5 μ L，10XPCR Buffer 2. 5 μ L，PI、P2 各 〇· 5 μ L，模版 DNA1 μ L，Fast Star 酶 0· 5 μ L，H20 18. 5 μ L。PCR 反应条件为：95 °C预变性 2min，95 °C 45s，50 °C 30s，72 °C 70s，扩增 30 个循环后，72 °C延伸 lOmin。PCR 结果 在1%琼脂糖凝胶上电泳检测(见图1，由图1可知目的基因片段680bp)，并用胶回收试剂盒 回收。将PCR产物与克隆载体pMD19-T连接并按照pMD19-T载体说明书进行，感受态的制 备、转化与阳性克隆的鉴定均按《分子克隆（第三版）》操作。挑取PMD19-T/ omp31阳性 克隆交由英潍捷基(上海）贸易有限公司。测序成功后，用Nde 1/ Xho I双酶切pMD19-T/ omp31，回收小片段即为目的基因片断。与经过相应核酸内切酶双酶切的pET-30a质粒连 接，连接产物转入大肠杆菌DH5a，阳性克隆提取质粒经PCR扩增及Nde 1/ Xho I双酶切 鉴定后，交由英潍捷基(上海)贸易有限公司。测序正确，成功构建表达载体pET-30a-〇mp31。
[0020] 布鲁氏菌重组膜蛋白omp31的制备 将构建的重组质粒pET-30a-〇mp31 (新疆石河子大学陈创夫教授惠赠）转化感受态 BL21。将重组菌摇至对数生长期后，以终浓度ImM IPTG加入诱导目的蛋白表达。诱导后超声 破碎，经鉴定目的蛋白主要处于沉淀中。将包涵体以2M尿素浓度的包涵体洗涤液（1 XPBS， 2M脲，0. 5% TritonX-100，lmmol/L EDTA，pH8. 0)洗涤后，目的蛋白纯度达85%以上。将洗 涤后的沉淀用6M盐酸胍（1XPBS，6M盐酸胍，pH8.0)溶解后进行梯度透析复性，复性后将 蛋白浓缩并测定蛋白浓度并用Western Blot分析其免疫原性(见附图2、3,图2, Μ :蛋白分 子质量标准；1 :〇. 2 mM IPTG诱导破菌后沉淀；2 :0. 6 mM IPTG诱导破菌后沉淀；3 :1. 0 mM IPTG诱导破菌后沉淀；4 :重组子未诱导全菌对照；5 :0. 2 mM IPTG诱导破菌后上清；6 :0. 6 mM IPTG诱导破菌后上清；7 :1. 0 mM IPTG诱导破菌后上清；图3,图A，M :marker ;1 :蛋白 复性与浓缩后上清；2 :洗涤后未溶解包涵体；图B，1 :一抗为免疫羊阳性血清；2 : -抗为阴 性血清)。
[0021 ] 当然，也可以使用其他方法制备得到的布鲁氏菌重组膜蛋白omp31，或直接购买纯 化的布鲁氏菌重组膜蛋白〇mp31。
[0022] 制备重组膜蛋白omp31的单克隆抗体 1.小鼠免疫 1) 选择6周龄的纯系雌性BALB/c小鼠，用纯化的重组omp31蛋白作为免疫抗原免疫小 鼠，将omp31蛋白与等体积的弗氏完全佐剂（CFA)乳化后，背部或腹腔皮下多点注射； 2) 初次免疫后2周将纯化的omp31与等体积的弗氏不完全佐剂（IFA)乳化后，背部或 腹腔皮下多点注射； 3) 2周后，小鼠尾部取血，离心获得血清将血清倍比稀释采用间接-ELISA方法测效价， 效价需不低于1 :51200 ; 4) 融合前三天，腹腔注射omp31蛋白； 三次免疫抗原的量分别为1〇〇 μ g/鼠、50 μ g/鼠、50 μ g/鼠。
[0023] 2.细胞融合 断颈处死上述免疫好的BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按 5:1在50% PEG4000融合剂下融合，融合后以HAT选择培养基铺板置于37°C 5%C02培养。
[0024] 3.阳性克隆筛选及克隆 利用纯化的重组〇mp31蛋白以间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，将阳性孔扩大 培养后，用有限稀释法进行细胞克隆，经过三次克隆获得1株能稳定传代并分泌抗〇mp31蛋 白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株〇mp31-5B3。
[0025] 单克隆抗体的鉴定 1.单克隆抗体的亚类鉴定 参照Hycult Biotechnol公司鼠源抗体分型试剂盒说明书对杂交瘤细胞omp31-5B3进 行鉴定，经鉴定〇mp31-5B3重链为IgG2a，轻链为κ链。
[0026] 2. Western-Blot 鉴定 按Bio-rad膜蛋白提取试剂盒说明书提取布鲁氏菌M5-90疫苗株膜蛋白，提取后膜蛋 白按1:1加入2XSDS上样缓冲液，沸水浴中煮5min，12000rpm离心lmin，取上清10 μ 1进 行分离胶12%，浓缩胶5%的SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上，PVDF膜以含5%脱 脂奶粉TBST封闭2h，随后以各株单抗的细胞上清1:3稀释孵育lh，TBST洗膜三次，每次 lOmin ;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG & IgM作为二抗孵育lh，TBST洗膜后发光显影。 试验中以HCV NS3的一株单抗作为阴性对照。试验结果显示omp31-5B3与天然膜蛋白在约 为31KDa处有一明显条带，而阴性对照HCV NS3的单抗不与膜蛋白反应（图4)。
[0027] Peptide-ELISA鉴定单克隆抗体omp31_5B3抗原识别表位 根据pET-30a-〇mp31测序结果设计并合成了 27条重叠肽，长度11?16个氨基酸，每 两条多肽之间重叠7个氨基酸(包括所有< 8个氨基酸残基的表位）（表1)。27条重叠多 肽0MP31 (P01-P27)每条多肽终浓度5 μ g/ml，每孔100 μ 1包被过夜；洗涤液PBST洗涤4 次后，以PBS+4%BSA，每孔200 μ 1 37°C封闭一小时；洗涤液洗涤4次后，以50 μ 1各单克隆 抗体株细胞上清+50 μ 1抗体稀释液（PBST+1%BSA)为一抗37°C孵育45min ;洗涤液洗涤6 次后，1:10000抗体稀释液稀释的HRP标记羊抗鼠 IgG+IgM为二抗，每孔100μ 1，37°C孵育 30min ;洗涤液洗涤6次后，加入ΤΜΒ-Η202，每孔100μ 1避光显色10min，每孔50μ 1 2M H2S04 终止反应。测量450nm波长下每孔的光密度（0D)。以杂交瘤细胞SP2/0细胞上清作为抗体 对照，以重组蛋白〇mp31作为抗原对照。以待测孔0D450nm彡2. 1倍阴性对照0D450nm判 为阳性。经过测定，单抗〇mp31-5B3和P24特异性反应（图5)。
[0028] 表1.重叠7个氨基酸的合成多肽
【权利要求】
1. 布鲁氏菌〇mp31蛋白B细胞表位，其序列为EYLYTDLGKRNLVDVD ( SEQ ID N0:24)。
2. 权利要求1所述布鲁氏菌omp31蛋白B细胞表位在制备布鲁氏菌病诊断试剂或治疗 药物中的应用。
3. 抗布鲁氏菌omp31蛋白的单克隆抗体，其制备方法为： 1) 将权利要求1所述的布鲁氏菌〇mp31蛋白B细胞表位免疫动物； 2) 取经免疫的动物脾细胞与瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗布鲁氏菌omp31蛋白的杂 交瘤细胞； 3) 收集、纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，即为抗布鲁氏菌omp31蛋白的单克隆抗 体。
4. 根据权利要求3所述的抗布鲁氏菌omp31蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述 单克隆抗体的重链为IgG2a、轻链为κ链，该单克隆抗体能与权利要求1所述的布鲁氏菌 omp31蛋白B细胞表位特异性结合。
5. 根据权利要求3所述的抗布鲁氏菌omp31蛋白的单克隆抗体，其特征在于：产生免 疫反应的动物的血清间接ELISA效价不低于1 :51200。
6. 权利要求3?5任一项所述的单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病试剂 或药物中的应用。
7. 稳定分泌权利要求3?5任一项所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
8. 分泌权利要求3?5任一项所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株omp31-5B3。
【文档编号】C12N5/20GK104086629SQ201410259477
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】王文敬, 廖卿宇, 李婷婷, 黎诚耀 申请人:南方医科大学