一种布鲁氏菌Omp10蛋白抗原表位多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种多肤，确切讲是一种布鲁氏菌OmplO蛋白抗原表位多肤及其应用。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌(Brucella),革兰氏阴性兼性细胞内寄生菌，是严重的人兽共患病，广泛 感染家畜、野生动物和人，家畜动物布鲁氏菌主要感染羊、牛和猪，其中对人致病的主要有 马耳他布鲁氏菌和流产布鲁氏菌;布鲁氏菌病感染家畜引起公畜的附睾炎和怀孕家畜的流 产、胎盘炎症和不育;对于人类，布鲁氏菌病课引起急性炎症和许多类似流感感染的症状， 包括波浪热、多汗、背疼和体质虚弱，在一些病人身上，急性临床症状可持续一年W上最终 导致慢性的持续性感染，慢性临床症状包括不规则的发热、关节疼、乏力，并发引起关节炎、 区部末梢神经炎症、脊柱炎、骨髓炎和粘液囊炎，布鲁氏菌病的流行不仅危害着畜牧业的发 展，造成了巨大的经济损失，而且严重威胁着人类的健康和公共卫生安全。
[0003] 目前，全世界用于预防布鲁氏菌病的有效疫苗均为减毒的活疫苗，各种疫苗的使 用不仅干扰着疫苗免疫和自然感染的鉴别诊断，而且所有的疫苗株不同程度的对人有致病 毒力，甚至有些疫苗对人为强致病力，安全可靠的灭活疫苗研究效果差，不能起到免疫保护 作用。基因工程疫苗的研究近几十年来一直被全世界研究人员所关注和努力，但由于布鲁 氏菌本身免疫抗原多样化，结构复杂，未能发现可用于田间试验的疫苗抗原，寻找存在于各 种布鲁氏菌种间保守存在且具有很好免疫功能的蛋白，研制预防保护力高的亚单位疫苗是 解决运一问题的有效办法。
[0004] 现有技术中大多数表达工具只能表达一种蛋白，而布鲁氏菌存在多种与免疫相关 的蛋白，研究表明单个蛋白的表达不能形成有效的保护疫苗用抗原，表达制备多个防控作 用的亚单位疫苗成本高，且组合成分复杂；而决定免疫蛋白功能的成分是位于蛋白上微小 的抗原决定簇，对免疫相关蛋白免疫抗原表位的挖掘和鉴定，可W有效的提取布鲁氏菌中 有效的免疫抗原成分，同时也对蛋白的结构和功能研究提供直接的指导，表位抗原成分的 确定，可为检测、预防或治疗能提供良好的抗原组分。因此筛选获得免疫蛋白上运些抗原决 定簇多肤为解决现有技术存在的不足提供了一种思路和途径。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种布鲁氏菌OmplO蛋白抗原表位多肤及其应用。
[0006] 本发明的布鲁氏菌OmplO蛋白抗原表位多肤氨基酸序列中含有SEQ ID NO. 1或/和 沈Q ID NO.2或/和沈Q ID NO.3或/和沈Q ID NO.4或/和沈Q ID NO.5。
[0007] 本发明的布鲁氏菌OmplO蛋白抗原表位多肤可W是其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1 或/和沈Q ID NO. 2或/和SEQ ID NO.3或/和沈Q ID NO.4或/和SEQ ID NO.5所示的序列经 过一个或/和几个氨基酸残基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肤；或者是其氨基酸 序列由沈Q ID NO. 1或/和沈Q ID NO. 2或/和沈Q ID NO.3或/和沈Q ID NO.4或/和沈Q ID NO. 5所示的序列，和添加有具有其它布鲁氏菌免疫源性功能的衍生的多肤。
[000引 由沈Q ID NO. I或/和沈Q ID NO.2或/和沈Q ID NO.3或/和沈Q ID NO.4或/和SEQ ID NO.5可构成的重组载体或表达盒或转基因细胞或重组菌。
[0009] 本发明所述的多肤在制备诊断或预防或治疗布鲁氏菌引起的疾病的试剂或药物 中的应用。
[0010] 本发明的沈Q ID NO. 1 或/和 SEQ ID NO. 2 或/和 SEQ ID NO. 3 或/和 SEQ ID NO. 4 或/和SEQ ID NO.5构成的多肤可W形成一种用于治疗或预防布鲁氏菌的药物组合物。
[0011] 布鲁氏菌OmplO免疫蛋白为第一组外膜蛋白组分，是布鲁氏菌脂多糖组成成分，与 布鲁氏菌阳性血清能发生强烈反应，具有免疫功能。本发明利用生物信息学的手段，对布鲁 氏菌OmplO免疫蛋白氨基酸的组成和功能进行分析，并模拟构建出蛋白的高级结构模型，综 合上述结果发掘出的蛋白上潜在的具有免疫功能的抗原多肤，化学合成运些多肤后，通过 实验验证手段最终获得功能多肤，制备出的布鲁氏菌OmplO免疫蛋白多肤为布鲁氏菌病的 检测、疫苗、防控提供新的思路，运也对于提高我国动物布鲁氏菌病的防治技术水平，保证 养殖业健康发展、提供农牧民收入、保证公共卫生和畜产品安全同样具有重大的社会效益。
[0012] 本发明的有益效果为：1)本发明筛选多肤为化学合成，而不是活的布鲁氏菌上提 取，因此在生产过程中完全避免了人为的制毒、散毒等安全隐患。2)本发明采用生物信息学 工具与试验验证相结合筛选抗原多肤，缩小的筛选抗原多肤的范围，提高了筛选效率。3)本 发明在树突状细胞上筛选抗原多肤，由于树突状细胞具有强大的抗原加工和递呈能力，结 果更为接近于动物模型。4)本发明所获得的多肤能与布鲁氏菌病阳性血清发生反应，故该 重组蛋白可作为目的抗原检测检测布鲁氏菌病感染的血清，如化ISA方法等。5)本发明所表 达的目的蛋白，可直接用于制备OmplO蛋白单克隆抗体的抗原。
【附图说明】
[OOK]图1是本发明实施例的树突状细胞培养图； 图2是本发明流式细胞仪检测树突状细胞的表型结果； 图3是本发明多肤作用树突状细胞后IL-2的分泌量;其中1-7依次为受试的各样本多 肤;8为已知抗原表位对照;9:阴性对照。
[0014] 图4是本发明多肤作用树突状细胞后IL-4分泌量，图中1-7依次为各受试样本多 肤;8为已知抗原表位对照;9为阴性对照； 图5是本发明多肤作用树突状细胞后IFN-y分泌量，图中1-7依次为各受试样本多肤;8 为已知抗原表位对照;9为阴性对照。
【具体实施方式】
[0015] W下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
[0016] -、实验材料的制备 1)抗原表位多肤的获得 用生物信息学软件对布鲁氏菌OmplO蛋白氨基酸的组成、性质W及其高级结构进行分 析，结合所有结果，挖掘获得可能具有免疫原性的屯个多肤片段，并委托南京金斯瑞生物科 技有限公司合成，得到各多肤序列如下:刊6?656酷?114肌?461605胖￥(569 10^.3，后述的 内容中为多肤样本1); 靈：GGIFETRTTDTNEKLAEGN(SEQ ID NO.l，后述的内容中为多肤样本2);戀 醒尺51￥36口'51(￥肥41^￥5口191^沈9 10^.4，后述的内容中为多肤样本3); ;丢诚口'554651?降1；11^酷(569 10^.5，后述的内容中为多肤样本4); 是~51(￥肥41^￥5口191肥155;(569 10^.2，后述的内容中为多肤样本5); 惠师1￥4口1^\11〇^\1^^〔61'(569 10^.6，后述的内容中为多肤样本6); 芭:GN化化SP化VEKSEQ ID NO.7,后述的内容中为多肤样本7)。
[0017] 2)小鼠骨髓源树突状细胞(DC)的培养颈椎脱位法处死BabVc小鼠，无菌状态下 取股骨和腔骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。用Iml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的 一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4~6遍，收集培养皿中的骨 髓细胞悬液，离屯、，1500 rpmX 10 min。弃去上清，加入5 ml无菌化is-N也Cl溶液悬浮细胞 溶解红细胞，于室溫下静置2分钟溶解红细胞后，再次离屯、，1500 rpmX 5 min,弃上清。用 RPMI-1640培养液洗涂后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完 全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，化-4终浓度lOng/ml。将细胞培养板 放入37°C，含5% 0)2的解箱中培养48~72小时。轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮 细胞，仅保留贴壁细胞。加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF，继续培养至第5天。 半量换液，并补足rmGM-CSF;尽量保留悬浮细胞。继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集 所有悬浮细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived den化itic cell，BMDC)，细胞在显微镜下观察期形态符合骨髓源树突状细胞的特征，参见图I;经流式 细胞仪检测表明细胞表面CDiic抗体达到70%W上，证明培养树突状细胞高达70%W上，能满 足实验要求，参见图2所示。
[0018] 3)多肤与DC的相互作用 收集培养7天的DC，计数，调整到1 X IO5细胞/ml浓度，将细胞按每孔500ul接种培养与 48孔细胞培养板，细胞培养体系中加入合成的多肤，终浓度为lOng/ml。每个多肤做3个平行 对照，同时用已经鉴定的多肤刺激细胞培作为阳性对照，W没刺激的细胞培养为空白对照， 作用30小时后，收集细胞培养上清，-80°C保存，W备做忍片检测。
[0019] 4化片操作流程 ?每个孔中加10化L的样品稀释液，室溫摇床上解育30min，封闭定量抗体忍片。抽去 每个孔中的缓冲液，添加10化L的标准液和样品到孔中，4°C过夜解育。
[0020] 戀清洗 抽去每个孔中的标准品或样品，IX洗液I清洗3次，每次IOmin室溫摇床震荡，每孔15化 L的1 X洗液I，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20 X洗液I。抽去每个孔中的1 X洗 液I，加入1 X洗液II清洗3次，每次5min室溫摇床震荡，每孔15化L的1 X洗液II，每次清洗 要抽干净洗液，用去离子水稀释20X洗液11(所有试剂由试剂盒提供）。
[0021] I?、险测抗体混合物的解育 离屯、检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离屯、。 添加8化L的检测抗