一种特异结合trb3的多肽在治疗或预防腹主动脉瘤中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肽及其衍生物在制备治疗或预防腹主动脉瘤的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 腹主动脉瘤指腹主动脉出现向侧面和前后搏动的膨胀性肿块，呈瘤样扩张，通常 主动脉直径增大50%以上可定义为动脉瘤。该疾病病变部位具有极高破裂风险，瘤体一旦 破裂，常伴有休克表现，死亡率高达78% -92%，严重威胁人类健康。瘤体未破裂时，患者常 伴有脐周及中上腹部剧烈疼痛症状，并发动脉粥样硬化、糖尿病、下肢动脉栓塞、肾积水等 疾病，严重影响患者生活质量。腹主动脉瘤常见于老年男性，男女发病之比为10:3。目前 尚针对腹主动脉瘤的治疗策略十分有限，大多数患者接受高风险和高成本的手术治疗。
[0003] 大量研究指出，腹主动脉瘤病理的发生发展与炎症因子白介素6、白介素8与氧 化应激堆积密切相关。自噬为机体病变的一种重要防御机制，经典的自噬被定义为通过溶 酶体途径清除细胞内冗余、错误折叠蛋白以及损伤细胞器，防止氧自由基堆积与炎症。P62 是自噬过程中重要的"货车蛋白"。P62蛋白结构域中含有泛素相关结构域（Ubiquitin associated domain, UBA)，与泛素化蛋白（(Ubiquitin，Ub)结合，作为"货车"将受损细胞 器或蛋白募集于自噬小体膜上的LC3,这个过程主要通过P62蛋白的LIR(LC3-Interacting Region, LIR)结构域实现，介导泛素化蛋白的降解，同时，P62的表达水平也随之降低。当自 噬受到抑制或自噬流被阻断时，P62与其结合的泛素化蛋白不能及时降解，在胞浆内堆积而 表达升高。胞浆内P62可与氧化应激形成恶性循环，造成细胞毒性，促进炎症发生发展。
[0004] TRB3 (Tribbles Homologue3)是Tribbles同源蛋白家族成员之一，最早在果蝇中 被鉴定到，并发现该蛋白能抑制有丝分裂，调节发育过程中细胞的增殖、迁移及形态形成。 在哺乳动物中，有三种Tribbles同源蛋白：TRBl，TRB2和TRB3,它们都是假激酶蛋白家族成 员。这三种蛋白都含有Ser/Thr蛋白激酶样结构域（Kinase like domain, KD)，但却缺乏ATP 的结合位点和催化残基，因此没有激酶活性。尽管如此，Tribbles蛋白却具有接头蛋白样 的功能，参与多种蛋白复合体的组装。在哺乳动物Tribbles家族成员中，TRB3的研究最为 深入，其相互作用蛋白包括转录因子、泛素连接酶、细胞膜上II型BMP受体以及MAPK、PI3K 信号通路成员。通过与这些蛋白相互作用，TRB3参与了糖脂代谢、脂肪细胞分化、凋亡、应 激和胶原表达等的调控。近来多种证据表明，TRB3在腹主动脉瘤相关疾病动脉粥样硬化的 发生发展过程中都具有重要的调节作用，提示TRB3可能是治疗腹主动脉瘤及其相关性疾 病的潜在靶点。
[0005] 有研究指出，TRB3与自噬底物p62相互结合，阻断自噬。因此，研究和开发TRB3蛋 白的抑制剂，或者阻断其与P62蛋白结合的物质，具有很好的恢复自噬流，治疗腹主动脉瘤 及其相关性疾病发生和发展的成药前景
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是针对目前缺乏能有效利用的TRB3蛋白抑制剂的现 状，而提供一种能特异性结合TRB3的多肽及其在制备治疗或预防腹主动脉瘤类药物中的 应用。
[0007] 本发明的发明人在研究的过程中发现，在腹主动脉瘤病变部位以及血管紧张素II 刺激的主动脉平滑肌细胞中，发现自噬经典指标LC3I向LC3II转化，表明自噬上游信号的 激活。发明人还进一步发现TRB3的表达量升高，与p62发生相互作用，阻断了自噬流，造成 腹主动脉瘤病变部位蛋白、炎症因子与氧化应激的堆积。基于发明人的研究工作，本发明提 供下述技术方案。
[0008] 本发明提供的技术方案是：一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物 在制备治疗或预防腹主动脉瘤的药物中的应用；
[0009] 所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO : 1所示序列；
[0010] 所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。
[0011] 本发明中，所述的如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中，可适当引入氨基酸替换， 缺失或添加，只要改变后的氨基酸序列仍然能够形成能与TRB3特异性结合的多肽且该多 肽仍然保持改变前的活性即可。
[0012] 本发明中，所述的细胞穿膜肽为本领域常规所述的细胞穿膜肽，只要其能辅助将 所述多肽送入细胞以发挥作用即可，一般而言，所述的细胞穿膜肽为由10~30个氨基酸 组成的短肽分子。所述的细胞穿膜肽较佳地为P印2多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所 示；即在本发明中，所述的多肽衍生物较佳地为以P印2多肽连接如SEQ ID NO :1所示序列 中的嵌合多肽。所述的细胞穿膜肽还可以为HIV-I病毒反转录激活因子（Trans-activator transcription，Tat)蛋白的 TAT 肽（YGRKKRRQRRR，其氨基酸序列如 SEQ ID :3 所示）、果 蝇触角同源异型蛋白的转录因子Antp肽（RQIKIWFQNRRMKWKK，其氨基酸序列如SEQ ID : 4所示）、P印-1肽（KETWWETWffTEWSQPKKKRKV，其氨基酸序列如SEQ ID :5所示）、MPG肽 (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV，其氨基酸序列如 SEQ ID :6 所示）和 R⑶肽（Arg-Gly-Asp， 其氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示）中的任一种或多种。所述细胞穿膜肽较佳地连接在所 述多肽的N端或者C端，更佳的是N端。
[0013] 本发明所述的多肽及其衍生物可以作为活性成分用于制备预防或治疗腹主动脉 瘤的药物。所述的"活性成分"是指具有预防或治疗腹主动脉瘤功能的化合物，即所述多肽 或所述多肽的衍生物用于制备预防或治疗腹主动脉瘤的药物。在该药物中，所述多肽或所 述多肽的衍生物可以单独作为活性成分，也可以和其他化合物一起作为活性成分。
[0014] 本发明中，所述的药物可以包含生理学或药学上可接受的载体，所述的载体可以 为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料，较佳地选自壳聚糖及其衍生物、卡波姆 和脂质体中的一种或多种。因此，在本发明中，所述的多肽或所述多肽的衍生物较佳地与所 述药物辅料组成药物组合物。所述的药物组合物可以为本领域常规所述的各种剂型，较佳 地是固体、半固体或液体的形式，可以是水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地是片剂、胶囊、 颗粒剂、注射剂或输注剂等。所述药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药，所 述注射给药较佳地包括：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射途径给药。 [0015] 本发明所述的药物组合物在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，使用 剂量较佳地为〇. 1~15mg/kg，更佳地为5~10mg/kg，最优选为5mg/kg，给药次数较佳地为 一天一次或数次。
[0016] 本发明中，所述的腹主动脉瘤为本领域常规所指的病理状态，包括：（1)腹主动脉 直径增大，呈瘤样，（2)炎症因子白介素6高度表达，3)炎症因子白介素8高度表达，（4)氧 化应激堆积，（5)细胞凋亡指标cleaved caspase3高度表达。
[0017] 在符合本领域常识的基础上，上述的各优选条件可任意组合，即得本发明各较佳 实例。
[0018] 本发明所用试剂和原料除特别说明之外，均市售可得。
[0019] 本发明的积极进步效果在于：本发明的多肽或多肽衍生物能够特异性地与TRB3 结合，从而阻断TRB3与P62蛋白的相互作用，恢复自噬流，该肽段的衍生物P印2-A2可以治 疗血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤，具有非常显著的疗效。
【附图说明】
[0020] 图1为用表面等离子共振方法验证多肽A2与蛋白TRB3的动力学结合曲线。其中 右图为A2和TRB3的结合曲线。
[0021] 图2为用酶联免疫吸附法（ELISA)验证多肽A2与蛋白TRB3的结合直方图。中阳 性对照为P62蛋白，阴性对照为牛血清白蛋白BSA。
[0022] 图3为用竞争酶联免疫吸附法（ELISA)验证多肽A2竞争TRB3和P62蛋白结合的 直方图。其中对照为TRB3与P62的结合直方图，A2代表加入多肽A2后TRB3与P62的结 合直方图。
[0023] 图4为用免疫共沉淀的方法验证在细胞水平多肽A2的衍生物P印2-A2对蛋白 TRB3和P62相互作用的影响。
[0024] 图5为用H&E染色方法证明相比于瘤旁对照，腹