一种多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学领域，涉及一种与PSM膜外区靶向性结合的多肽、放射性核素标 记多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 前列腺癌（PCa)已成为目前危害全球男性健康的主要恶性肿瘤，早期主要通过 外科手术和放射治疗，但早期发现困难，就诊时多数已发生远处转移。未经治疗的PCa细 胞多为雄激素依赖性，即通过阻断雄激素促使雄激素依赖性癌细胞凋亡，但雄激素依赖 性PCa经过一段时间（平均14-30月）内分泌治疗后，大多数转为非激素依赖性前列腺 癌（androgenindependentprostatecancer,AIPC)，最终转化为激素难治性前列腺癌 (Hormonerefractoryprostatecancer,HRPC)，目前对于HRPC及其转移灶尚无有效的治 疗方法，临床统称为难治性前列腺癌，是导致PCa预后差、死亡率高的主要原因。
[0003] 125Kltl3Pd粒子近距离放射治疗及外放疗是HRPC的治疗手段，但主要限于局部病 灶。针对多发病灶的靶向内放射性治疗近年来备受关注，mLu是理想靶向内放射治疗性核 素，常用于抗体、多肽及其类似物等的标记，且mLu通过反应堆辐射产生，具有低成本和易 得性，具有适宜的物理半衰期（6. 7d)，发射的0-粒子传能线密度及生物学效应高于1251， 组织平均射程小于200ym，适合杀死癌细胞，发射的Y射线可用于SPECT显像，以监测和指 导治疗过程，因此，如何增加理想治疗性核素mLu在HRPC及转移灶的靶向性聚集和滞留是 改善其预后亟待解决的难题，其中受体和配体的选择尤为重要。
[0004]前列腺特异性膜抗原（prostatespecificmembraneantigen，PSMA)是一种II 型跨膜糖蛋白，其大小约为100-120kD。它由3部分构成：短的胞内段（氨基酸1-18)，跨膜 段（氨基酸19-43)和较长的胞外段（氨基酸44-750)，在高度恶性原发性PCa、HRPC及其 转移灶的肿瘤细胞表面呈高丰度表达，且随PCa恶性进展而升高，而在前列腺、肾脏、肺脏、 肝脏等正常组织、炎性增生性组织及其它良性病变细胞表面表达水平极低、甚至不表达，成 为HRPC及其转移灶靶向治疗的主要靶蛋白。
[0005] 作为配体，多肽较抗体分子量小，稳定性好，无免疫源性，不被网状内皮系统非特 异性摄取，可通过化学修饰连接NOTA、CB-TE2A、PCTA、DOTA等偶联物，进行放射性核素（如 68Ga，mIn，9°Y，177Lu等核素）标记，体外类合成（如固相法）过程简单、经济，为广泛临床应 用提供了基础。更重要的是，多肽作为放射性核素载体，通过结构优化可获得体内药代动力 学良好如血清除快、靶向特异性好、结合稳定的多肽。
[0006] 若能够研制出一种能与PSM胞外区特异性结合特性和具有靶向功能的多肽，对 于PCa的诊断和治疗具有较好的应用前景。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对上述技术问题提供一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽。
[0008] 上述与PSMA膜外区靶向性结合的多肽的氨基酸序列为SEQIDNO: 1 ;
[0009]SEQIDNO:I:Glu-Val-Pr〇-Arg-Leu-Leu-Ser-Leu-Ala-Val-Phe-Leu〇
[0010] 进一步的，所述多肽与PSM胞外段，氨基酸44-750,靶向结合，并与偶联剂通过聚 乙二醇（PEGn，n= 0, 1，2, 3)连接，所述偶联剂介导多肽的放射性核素的标记。
[0011] 进一步的，所述偶联剂为DOTA、或NOTA、或CB-TE2A、或Hynic。
[0012] 进一步的，所述放射性核素为68Ga,或mIn，或9°Y，或177Lu,或64Cu。
[0013] 上述与PSM膜外区靶向性结合的多肽还具有在制备治疗或诊断前列腺癌的靶向 性药物中的应用。
[0014] 本发明还提供一种制备上述与PSM膜外区靶向性结合的多肽的方法，包括以下 步骤：①多肽从C端到N端方向合成，先在树脂上挂第一个氨基酸，称取2.Og树脂于洁净 干燥的反应管中，加入适量二甲基甲酰胺DMF，活化30min左右，然后称取第一个氨基酸 Fmoc-Leu(But)-OH0.5mmol，4_ 二甲氨基卩比啶DMAP75mg，N，N'_ 二异丙基碳二亚胺DIC Iml加入到反应管中，DMF做溶剂反应3h;反应完毕用DMF洗4?6次，加入适量吡啶和甲 醇，体积比为1: 1，反应30min;反应完毕用DMF洗4?6次；然后用哌啶溶液脱掉氨基酸的 Fmoc，脱两次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量树脂用茚三酮 检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应；
[0015]②称取第二个氨基酸Fmoc-Phe-OHI. 5mmol，苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲 六氟磷酸酯JBTU1.5mmol于反应管中，加入DIEA0.5ml，反应40min，用DMF洗4?6次， 取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入哌啶溶液脱Fmoc，10min+5min，然后 用DMF洗4次，甲醇洗两次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下 一步反应；
[0016] ③以下氨基酸反应方法同②；
[0017] ④称取0? 75mmol偶联剂DOTA，HBTUI. 5mmol于反应管中，加入N，N-二异丙基乙 胺DIEA0. 25ml，经过用茚三酮检测试剂检测，检测为无色；
[0018] ⑤最后用三氟乙酸切割液切割2h，反应液抽滤，得多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉 淀，离心，然后再用乙醚洗3?5次，得白色固体，经HPLC纯化，冻干，得多肽D0TA-PSMAP。
[0019] 本发明还提供一种将权利要求1中所述的多肽制备成放射性核素标记多肽的方 法，配置权利要求1所述的D0TA-PSMAP多肽溶液为2mg/ml;HEPES为1M，PH为7;放射性核 素溶液为l-l〇mCi/ml;
[0020] 取25y1的HEPES液，分别依次加入0. 7-5yID0TA-PSMAP多肽溶液和 100U1的放射性核素溶液，置于95°C的水浴锅中加热，反应15-30min即得到放射性核 素-D0TA-PSMAP。
[0021] 步骤④中的偶联剂D0TA，还可以替换成其他的，例如或N0TA、或CB-TE2A、或 Hynic0
[0022] 放射性核素溶液为 68GaCl3，或 64CuCl2，或 111InCl3，或 177LuC13。
[0023] 本本发明首次通过体外固相法合成PSMA膜外区靶向性结合的小分子直线多肽， 其结构为多肽氨基酸序列为Glu-Val-Pro-Arg-Leu-Leu-Ser-Leu-Ala-Val-Phe-Leu(SEQ IDNo: 1)，即谷氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-亮氨酸-丙氨 酸-缬氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸（以下简称PSMP)，可与PSM胞外段（氨基酸44-750)靶 向结合，并与偶联剂（如0(7^、勵了4、08-了￡24、办111(3等）通过聚乙二醇（?￡6 11，11 = 0，1，2,3) 连接，偶联剂介导多肽的放射性核素（如68Ga、64Cu、mIn、177Lu和"-Tc)的标记。其中放射 性核素可以是显像性放射性核素如64Cu、68Ga、mIn，也可以是治疗性放射性核素如9°Y、mLu 等。体外实验考查其体外稳定性，体内实验考察其体内药代动力学和生物学分布，并通过 MicroPET/CT(或microSPECT/CT)显像评价其在前列腺癌肿瘤部位的放射性摄取。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 本发明制备的小分子多肽PSMAP，能与PSM膜外区靶向性结合，利用该多肽制备 的放射性核素标记多肽，可作为诊断或治疗前列腺癌的靶向性药物，具有较好的效果。
[0026] 同抗体不同，该多肽无免疫源性，分子量小，血液清除快，肝脾等富网状内皮系统 摄取少且清除快，在前列腺等组织中分布少，而在前列腺癌（及其转移）病灶部位浓聚多， 且滞留时间长，可有效作为诊断和治疗用放射性核素的载体。
[0027] PSM膜外区长，高特异性结合的多肽序列