一种新型生物活性多肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新型生物活性多肽及其制备方法，具体涉及一种通过阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC分离获得新型生物活性多肽的方法。
【背景技术】
[0002]生物毒素是一种重要的生命现象，是生物界在亿万年进化过程中为了生存而形成的，是一个巨大的潜在发现新的生物活性分子的重要资源。目前国际上已经成功筛选到一些生物毒素分子用于治疗某些相关疾病或作为新型药物的设计参考。蜘蛛产生各种作用于神经系统的神经毒素，其神经毒素根据它们的化学结构分为蛋白多肽类神经毒素和多胺类神经毒素。其中蜘蛛多肽神经毒素最重要，蜘蛛多肽类神经毒素根据它们的功能和分子特征可分为两种类型:第一种是低分子量多肽类，它们能与兴奋性细胞膜上的阳离子通道相互作用；第二种是高分子量多肽类，它们与突触前膜的受体组分及增强神经介质的分泌作用密切相关。蜘蛛毒液已成为神经毒素的一个重要新来源，而且蜘蛛毒液中特异性药物和毒素分子也是我们寻找农业杀虫剂的较好模式分子。
【发明内容】
[0003]本发明的目的旨在于提供一种从广西缨毛蛛粗毒中制备新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽为蜘蛛抑钾肽-X (SPKP-X)，其氨基酸序列为:
NH2-Leu Cys Ser Arg Glu Gly Glu Phe Cys Tyr Lys Leu Arg Lys Cys Cys AlaGly Phe Tyr Cys Lys Ala Phe Val Leu His Cys Tyr Arg Asn-OH0
[0004]所述的蜘蛛抑钾肽-X的N端第I位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之间分别形成^■硫键。
[0005]所述方法包括:(1)将广西缨毛蛛粗毒干粉用双蒸水溶解配成5mg/mL的毒素溶液，12 OOOrpm离心5 min,置于4°C保存。粗毒上样阳离子交换HPLC进行第一步分离。采用 Waters 650 型 HPLC、美国 Pharmacia 公司的 Hiprep?16/10 CM FF 预装柱进彳丁分离。486检测器检测，检测波长为215nm。流动相为四相洗脱系统，流速为3 mL/min。洗脱液分别为A相0.1M磷酸二氢钠，B相0.1M磷酸氢二钠，C相IM氯化钠，D相双蒸水(ddH20)。其中A液和B液用来调节洗脱液的pH值，采用氯化钠梯度洗脱。上述经阳离子交换HPLC分离后收集的各洗脱峰分别上样反相HPLC进行进一步纯化。(2)反相高效液相色谱分离脱盐纯化:在Pharmacia公司的AKTA蛋白纯化系统上完成，采用大连依利特公司的C18反相制备柱。(3)第三步采用分析型Vydac C18 RP-HPLC反相柱(218TP54，4.6X250 mm)于分析型Waters 2690高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，996检测器检测，检测波长为280nm，流动相为含0.1%TFA的水(A)和乙腈(B)，洗脱速度为lmL/min，柱温为40°C。
[0006](2)通过上述阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC共三步分离获得的SPKP-X，运用质谱鉴定纯度达到98%以上，其分子量约为3706.2 Da，经序列测定，该多肽的一级结构由31个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。多肽SPKP-X纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。
[0007]
【附图说明】
[0008]图1是广西缨毛蛛粗毒阳离子交换HPLC图谱。表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在280 nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间。
[0009]图2是广西缨毛蛛粗毒目的阳离子交换峰反相HPLC图谱。表示目的峰，纵坐标表示各个洗脱峰在280 nm下的吸收值，横坐标表示洗脱时间。
[0010]图3是SPKP-X的反相HPLC图谱。
[0011]图4 是 SPKP-X 的 MALD1-T0F 质谱图谱。
[0012]
【具体实施方式】
[0013]1、实验材料和方法 1.1粗毒的获取
广西缨毛蛛采集于海南省琼中县境内的山区，粗毒毒液采于雌性蛛种。简述如下:使蜘蛛张开螯爪伸入塑料杯中，然后用5?10 V的脉冲电流刺激两螯肢基部外侧3?5 S。蜘蛛感受电刺激后，即用触肢紧紧抱住杯壁，同时将螯爪有力刺向杯内壁并射出毒液。毒液收集后，放入_40°C冷冻干燥机中经真空冷冻干燥成浅黄色或白色粉末即为粗毒。
[0014]1.2粗毒的分级分离及质谱鉴定
JZTX -X的分离纯化分为三步。首先，将粗毒干粉用双蒸水溶解配成5mg/mL的毒素溶液，12 OOOrpm离心5 min,置于4°C保存。粗毒上样阳离子交换HPLC (1n-exchangeHPLC)进行第一步分离。米用Waters 650型HPLC、美国Pharmacia公司的Hiprep?16/10CM FF预装柱进行分离。486检测器检测，检测波长为215nm。流动相为四相洗脱系统，流速为 3 mL/min ο 洗脱液分别为 A 相 0.1M NaH2PO4, B 相 0.1M Na2HPO4, C 相 IM NaCl, D 相ddH20o上述经阳离子交换HPLC分离后收集的各洗脱峰分别上样反相HPLC进行进一步纯化。第二步，反相高效液相色谱分离脱盐纯化:在Pharmacia公司的AKTA蛋白纯化系统上完成，采用大连依利特公司的C18反相制备柱。第三步采用分析型Vydac C18 RP-HPLC反相柱(218TP54，4.6X250 mm)于分析型Waters 2690高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，996检测器检测，检测波长为280nm，流动相为含0.1%TFA的水(A)和乙腈(B)，洗脱速度为lmL/min，柱温为 40 °C。
[0015]利用MALD1-TOF 质谱(Voyager_DE0STR B1spectromitryO workstat1n)检测分子量并判断所得到的样品的纯度。采用线性阳离子模式；N2光源337 nm;离子加速电压为20000 Vo基质为α-氰基-4-羟基-肉桂酸(CCA)，通过以下方式制备样品:取I mL (约
0.5 mg)样品液加入到5 mL CCA 0.l%TFA/50%乙腈饱和溶液，混匀后取0.5 mL点样，室温干燥后测定分子量，并采用内标法校正。
1.3氨基酸序列测定
氨基酸序列分析是应用Edman降解原理，在Perkin Elmer Procise 491A型气相测序仪(美国Applied B1system公司产品)上进行的。一般不直接使用天然毒