一种丝素蛋白乳状液滴及其制备方法与流程

本发明涉及乳液技术领域，尤其涉及一种丝素蛋白乳状液滴及其制备方法。

背景技术：

表面活性剂是分子中具有亲水基与疏水基，能富集或吸附于界面，使界面性质发生显著改变而出现界面活性的物质。近年来，乳液在化工、食品、医药、化妆品、组织工程修复以及生物检测等领域发挥了很大的作用。而对于人工合成的高聚物乳化所形成的乳液，往往存在合成方法复杂、副产物多、后处理复杂、毒性大、稳定性差以及尺寸可控性差等特点，从而使其应用领域受限。

近年来，利用多肽分子在互不相容的水油界面自组装形成网络结构已有初步的探索，但仍存在尺寸难以调控、稳定性差等特点。而丝素蛋白由于具有良好的生物相容性、优良的机械性能及可调节的降解速度、在水溶液中可加工处理、可再生形成可注射的纳米颗粒、微球、水凝胶和粘合剂以及固定位置植入的薄膜和支架等各种形态，使其作为一种天然材料在生物医用领域具有广泛的应用。另外，由于丝蛋白具有良好的亲疏水性的特点，使其在表面活性剂领域的应用越来越引起关注。但新鲜的再生丝蛋白溶液由于其高浓度下有严重的皂化现象且有机相高于60％时，体系流动性显著下降。现有技术中，还未有直接利用丝蛋白纳米纤维经过一定条件的乳化过程制备尺寸可调、稳定性好且表面为介孔结构的乳液的先例。

因此，针对上述技术问题，有必要提供一种稳定的丝素蛋白乳状液滴的制备方法，该方法还可通过改变乳化条件使丝素蛋白乳状液滴尺寸可调、稳定性好且具有复杂的纳米纤维-介孔结构。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于提供一种尺寸可调，稳定性好且表面具有介孔结构的丝素蛋白乳状液滴及其制备方法。

有鉴于此，本申请提供了一种丝素蛋白乳状液滴，所述丝素蛋白乳状液滴的直径为200nm～100μm，其结构为beat-sheet结构，表面具有介孔结构。

优选的，所述丝素蛋白乳状液滴的乳化类型为水包油型。

本申请还提供了上述方案所述的丝素蛋白乳状液滴的制备方法，包括以下步骤：

a)，将生丝或蚕茧脱胶，再溶解透析得到丝素蛋白原溶液，然后依次进行浓缩、稀释和孵育，得到丝素蛋白纳米纤维；

b)，将所述丝素蛋白纳米纤维进行分散，得到丝素蛋白纳米纤维溶液；

c)，将得到的丝素蛋白纳米纤维溶液与水油混合溶剂混合，乳化后得到丝素蛋白乳状液滴。

优选的，在步骤a)中，所述溶解的溶剂包括溴化锂、氯化钙-乙醇-水三元溶液与硝酸钙水溶液。

优选的，在步骤a)中，所述丝素蛋白纳米纤维的直径为10～20nm，长度为100nm～2μm，结构为beat-sheet结构。

优选的，在步骤b)中，所述丝素蛋白纳米纤维的浓度为0.1～3wt％。

优选的，在步骤b)中，所述分散的转速为500～30000rpm，时间为1～60min。

优选的，在步骤c)中，所述水油混合溶剂中水相与油相的体积比为1:9～9:1。

优选的，在步骤c)中，所述水油混合溶剂中的油相选自十二烷、正己烷、正己醇和丁酸丁酯中的一种或多种。

优选的，在步骤c)中，所述乳化的转速为500～30000rpm，时间为1～60min。

本申请提供了一种丝素蛋白乳状液滴的制备方法，在制备丝素蛋白乳状液滴的过程中，本申请首先将生丝或蚕茧经过脱胶、溶解透析、浓缩、稀释与孵育，得到了丝素蛋白纳米纤维；再将得到的丝素蛋白纳米纤维进行分散，得到丝素蛋白纳米纤维溶液，最后将丝素蛋白纳米纤维溶液与水油混合溶剂混合，乳化后得到丝素蛋白乳状液滴。在上述过程中，本申请利用再生的丝素蛋白原溶液制备了高结晶的丝素蛋白纳米纤维，其具有疏水性能够在油水界面分布，促进乳化的产生，得到乳状液滴；同时高结晶的丝素蛋白纳米纤维使得丝素蛋白能够相互缠绕，形成稳定的包覆层，进一步的，其具有更高的电荷密度，则提供了更强的电荷斥力，避免了乳滴聚集，进一步提高了乳状液滴的稳定性；另一方面，丝素蛋白乳状液滴的尺寸可根据水油混合溶剂的比例进行调节，而使丝素蛋白乳状液滴的尺寸可调；纳米纤维之间的物理缠绕及静电斥力的平衡，使其表面具有复杂的介孔结构。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的不同水油比例的丝素蛋白乳状液滴的宏观照片；

图2为本发明实施例1制备的不同水油比例的丝素蛋白乳状液滴的荧光显微镜图；

图3为本发明实施例1制备的水油比例为9:1的下层液体的荧光显微镜图；

图4为本发明实施例1制备的丝素蛋白纳米纤维溶液的扫描电镜图；

图5为本发明实施例1制备的丝素蛋白乳化前后的红外光谱图；

图6为本发明实施例1制备的丝素蛋白乳状液滴的稳定性试验结果照片；

图7为本发明实施例1制备的丝素蛋白乳状液滴冻干后的微观照片；

图8为本发明实施例1中s1步骤中浓缩前后的丝蛋白形貌afm照片；

图9为本发明对比例1制备的不同水油比例的丝素蛋白乳状液滴的宏观图；

图10为本发明对比例1制备的不同水油比例的不同尺寸的丝素蛋白乳状液滴的荧光显微镜图；

图11为本发明对比例1在水油比例1:9以及高浓度下形成的丝素蛋白弹性凝胶的图片。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种丝素蛋白乳状液滴，所述丝素蛋白乳状液滴的直径为200nm～100μm，其结构为beat-sheet结构，表面具有介孔结构。

本申请提供的丝素蛋白乳状液滴其尺寸可调，其直径在200nm～100μm范围内可调，具有高beta-sheet含量的稳定结构，乳化类型为水包油型。本申请提供的丝素蛋白乳状液滴表面具有复杂的纳米纤维-介孔结构。

为了得到上述丝素蛋白乳状液滴，本发明提供了所述丝素蛋白乳状液滴的制备方法，包括以下步骤：

a)，将生丝或蚕茧脱胶，溶解透析得到丝蛋白原溶液，再依次进行浓缩、稀释和孵育，得到丝素蛋白纳米纤维；

b)，将所述丝素蛋白纳米纤维进行分散，得到丝素蛋白纳米纤维溶液；

c)，将得到的丝素蛋白纳米纤维溶液与水油混合溶剂混合，乳化后得到丝素蛋白乳状液滴。

在上述过程中，首先将生丝或蚕茧脱胶，溶解透析得到丝素蛋白原溶液，再将所述丝素蛋白原溶液依次进行浓缩、稀释与孵育，得到丝素蛋白纳米纤维。在此过程中，所述丝素蛋白为本领域技术人员熟知的原料，本申请对其来源没有特别的限制。所述脱胶与溶解透析的过程为本领域技术人员熟知的技术手段，此处对其技术手段不进行特别的限制。所述溶解透析的溶剂体系为本领域技术人员熟知的溶剂，示例的，所述溶剂选自溴化锂、氯化钙-乙醇-水三元溶液以及硝酸钙水溶液。得到丝素蛋白原溶液之后，将其依次进行浓缩、稀释与孵育，得到的丝素蛋白为纳米纤维结构，其直径为10～20nm，长度为100nm～2μm，主要为beat-sheet结构。上述浓缩、稀释和孵育(热处理)的过程是为了通过调控丝蛋白分子的亲疏水作用、浓度、分子运动性等等因素，使丝蛋白纳米颗粒自组装成纳米纤维。

上述制备的丝素蛋白纳米纤维为一种高结晶的丝素蛋白纳米纤维，其纳米纤维结构的形成使得丝素蛋白能够相互缠绕，形成稳定的包覆层，以提高丝素蛋白乳状液滴的稳定性，同时丝素蛋白纳米纤维还具有更高的电荷密度，则提供了更强的电荷斥力，以避免形成的丝素蛋白纳米纤维乳状液滴的聚集，进一步提高乳滴的稳定性，纳米纤维之间的物理缠绕及静电斥力的平衡，使其表面具有复杂的介孔结构。

本申请然后以丝素蛋白纳米纤维作为乳化剂，以制备得到丝素蛋白乳状液滴。上述制备的丝素蛋白纳米纤维具有疏水性，其能够在油水界面分布，促进乳化的产生，得到乳状液滴。按照本发明，将丝蛋白纳米纤维分散均一，得到丝素蛋白纳米纤维溶液。所述丝素蛋白纳米纤维的浓度为0.1～3wt％，在具体实施例中，所述丝素蛋白纳米纤维的浓度为0.2～2wt％。所述分散在一定的转速、一定的时间下进行分散，所述转速为500～30000rpm，时间为1～60min；在具体实施例中，所述转速为10000～15000rpm，时间为10～30min。

最后将所述丝素蛋白纳米纤维溶液再水油混合溶剂中进行乳化，得到丝素蛋白乳状液滴。所述丝素蛋白乳状液滴的尺寸主要取决于水油相比例，随着油相的减少，粒径尺寸先增大后减少，乳状液滴在200nm～100μm范围内可调，所述水油混合溶液中水相与油相的体积比为1:9～9:1。所述乳化的转速为500～30000rpm，时间为1～60min；在具体实施例中，所述乳化的转速为2500～15000rpm，时间为10～30min。所述水油混合溶剂中的油相需要为疏水性的有机溶剂，示例的，所述油相选自十二烷、正己烷、正己醇和丁酸丁酯中的一种或多种。

本发明的关键在于采用高结晶的丝蛋白纳米纤维作为乳化剂，其疏水性使其能够在油水界面分布，促进乳化的产生，而丝素蛋白纳米纤维的结构则使乳化的乳滴具有稳定性。普通的丝蛋白溶液无法达到相似效果，因此，本技术的核心在于具有疏水性、高结晶的丝蛋白纳米纤维的形成，才可获得高质量的乳状液滴。本发明采取直接利用已经beta-sheet化的丝素蛋白纳米纤维形成乳液，通过改变乳化过程中的水油混合溶剂的比例，制得一种尺寸可调、稳定性好，表面为介孔结构的乳滴粒子。进一步的，由于高结晶的丝蛋白纳米纤维具有更高的电荷密度，从而能够提供更强的静电斥力，使得乳状液滴稳定分散；丝蛋白纳米纤维的高结晶性使得丝蛋白分子的亲疏水片段的分布更为规律，在水油界面上，疏水部分能更好的分散到油相，亲水部分则更多的在水相分布，分散性得到更好的提高。

本申请在制备丝素蛋白乳状液滴的过程中，通过对丝素蛋白纤维质量、乳化速度及乳化时间的控制，实现对丝素蛋白纤维尺寸剪切破坏程度的控制，随后通过加入不同极性的有机溶剂及不同的水油配比进行乳化处理，最终获得尺寸可调、稳定性好，表面为介孔结构的丝素蛋白纳米纤维组成的乳状液滴。在上述过程中，通过对丝素蛋白纤维质量的控制，最终获得不同尺寸的丝素蛋白乳液；通过调控转速和时间，最终获得不同尺寸的丝素蛋白乳液；通过改变不同极性的有机溶剂，最终获得不同尺寸的丝素蛋白乳液；通过调控不同的水油配比，最终获得不同尺寸的丝素蛋白乳液。同以往的其他多肽分子自组装形成的乳液相比，本发明所制备的丝素蛋白乳状液滴尺寸可调，为高beta-sheet含量的稳定结构，负电性高、稳定性好，且分散性好、不易聚集，有利于以此为药物载体构建不同功能和释放行为的载药丝素蛋白颗粒，以及在化工、食品、化妆品、组织工程、生物检测等领域有更广泛的应用；同时本申请丝素蛋白乳状液滴的制备方法，工艺简单、可批量生产、冻干处理后材料强度高、生物相容性好。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的丝素蛋白乳状液滴的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

s1：将生丝脱胶，溴化锂溶解透析制备原溶液，再经过可控浓缩、稀释和孵育的方法制得丝蛋白纳米纤维；

s2：将0.1％的丝蛋白纳米纤维在500rpm、10min下分散成均一的纳米纤维溶液；

s3：将所述纳米纤维溶液中分别加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶剂，在2800rpm、10min的乳化作用下形成丝素蛋白乳状液滴。

图1为本发明实施例1制备的不同水油比例的丝素蛋白乳状液滴的宏观图；图2为本发明实施例1制备的不同水油比例的不同尺寸的丝素蛋白乳状液滴的荧光显微镜图；图3为本发明实施例1水油比例为9:1的下层液体的荧光显微镜图；图4为本实施例s2制备得到的丝蛋白纳米纤维水溶液的扫描电镜图；图5为本发明丝蛋白纳米纤维乳化前后的红外光谱图。由图可知，本发明中的丝素蛋白乳状液滴，其直径在200nm～100μm之间，稳定性好，乳化类型为水包油型。

图6为本发明实施例1制备的丝素蛋白乳状液滴室温与60℃下存储状态的照片，图中rt中的d0、d36与d110分别表示第0、36与110天的存储状态照片，60℃中的d0、d36与d90分别表示第0、36与90天的存储状态照片；由图6可知，室温或高温的存储条件本申请制备的丝素蛋白乳状液滴的状态未发生变化。

检测本实施例制备的丝素蛋白乳状液滴的强度，afm测得，本实施例制备得到的丝素蛋白乳状液滴的弹性模量为25.4mpa；图7为丝素蛋白乳状液滴冻干后的表面形貌，由图可知，丝素蛋白乳状液滴冻干后样品表面无大面积破损，且表面形成介孔结构。

图8为本实施例s1步骤中浓缩前后的丝蛋白形貌afm照片。

实施例2

s1：将丝蛋白脱胶，溴化锂溶解透析制备原溶液，再经过可控浓缩、稀释和孵育的方法制得丝蛋白纳米纤维；

s2：将0.2％的丝蛋白纳米纤维在10000rpm、1min下分散成均一的纳米纤维溶液；

s3：将所述纳米纤维溶液中分别加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶剂，在10000rpm、10min的乳化作用下形成丝素蛋白乳状液滴。

实施例3

s1：将丝蛋白脱胶，氯化钙-乙醇-水三元溶液溶解透析制备原溶液，再经过可控浓缩、稀释和孵育的方法制得丝蛋白纳米纤维；

s2：将0.5％的丝蛋白纳米纤维在15000rpm、30min下分散成均一的纳米纤维溶液；

s3：将所述纳米纤维溶液中分别加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶剂，在15000rpm、30min的乳化作用下形成丝素蛋白乳状液滴。

实施例4

s1：将丝蛋白脱胶，硝酸钙水溶液溶解透析制备原溶液，再经过可控浓缩、稀释和孵育的方法制得丝蛋白纳米纤维；

s2：将3％的丝蛋白纳米纤维在30000rpm、10min下分散成均一的纳米纤维溶液；

s3：将所述纳米纤维溶液中分别加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶剂，在30000rpm、60min的乳化作用下形成丝素蛋白乳状液滴。

实施例5

s1：将丝蛋白脱胶，硝酸钙水溶液溶解透析制备原溶液，再经过可控浓缩、稀释和孵育的方法制得丝蛋白纳米纤维；

s2：将3％的丝蛋白纳米纤维在30000rpm、20min下分散成均一的纳米纤维溶液；

s3：将所述纳米纤维溶液中分别加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶剂，在20000rpm、60min的乳化作用下形成丝素蛋白乳状液滴。

对比例1

s1：将0.2％的普通丝蛋白原溶液分别加入不同配比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)的水油混合溶剂，在2800rpm、10min的乳化作用下形成丝素蛋白乳状液滴。

图9为本发明对比例制备的不同水油比例的丝素蛋白乳状液滴的宏观图；图10为本发明对比例制备的不同水油比例的不同尺寸的丝素蛋白乳状液滴的荧光显微镜图；图11为本发明对比例在水油比例1:9以及高浓度下形成的丝素蛋白弹性凝胶图片。由图9～图11可知，采用普通丝素蛋白原溶液形成的乳液在水油比例为1：9下及高浓度下都不会形成乳液，而是为弹性凝胶；且尺寸不好调控，分散性及乳化性能不好；这是由于与丝蛋白纳米纤维乳化机理不同，普通丝蛋白原溶液是在乳化的过程中进行自组装，使乳滴间分散不好或者有粘连。

本申请利用采用上述实施例1～5的方法了制备尺寸可调、稳定性好、表面为介孔结构的丝素蛋白乳状液滴，制备工艺简单，且得到的产物为水包油型，强度高、生物相容性好。

本发明提出一种尺寸可调、稳定性好、表面为介孔结构的丝素蛋白乳状液滴及其制备方法，丝素蛋白乳状液滴的直径在200nm～100μm之间，稳定性好，表面为介孔结构，乳化类型为水包油型。该丝素蛋白乳状液滴的尺寸均一性较高，分散性好、不易聚集，且为高beta-sheet含量的稳定结构，有利于以此为药物载体构建不同功能和释放行为的载药丝素蛋白颗粒，以及在化工、食品、化妆品、组织工程等领域有更广泛的应用。在制备丝素蛋白乳状液滴的过程中，通过对溶剂类型、丝素蛋白纤维质量、乳化速度、乳化时间及水油配比的调控，最终形成尺寸可调、稳定性好、表面为介孔结构的丝素蛋白乳状液滴，同时，该种制备方法，工艺简单，可批量生产，生物相容性好。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。