本发明涉及生物制品技术领域，尤其是涉及新月藻活性蛋白的制备方法。
背景技术：
微藻作为优良的天然饵料被广泛应用于水产养殖，是多种软体动物、甲壳类幼体和浮游动物（如轮虫）的主要食源。微藻的饵料价值与许多因素有关，包括细胞大小、细胞壁的可消化程度和细胞内容物的生化组成，尤以后者最为重要。很早就有人注意到环境因子的改变对微藻生长及生化成分的影响，后续研究相继阐述了各种微藻在不同的培养基配方、不同的培养方式以及不同的温度、光强、通气量、盐度、qd、光周期和光质下细胞内生化成分的变化。新月藻(closlerium)属于绿藻门，接合藻月、鼓燕科。已记录的超过300种，生活在各种谈水水体中。新月藻为单细胞体，细胞为新月形，中央有一核，核两边各有一个叶绿体。叶绿体的表面有纵的条状突起，横切面呈芒状；叶绿体中有1列造粉核。细胞两端各有一个液泡，其中有转动的石膏结晶。与新月藻同类的还有鼓藻，但细胞形状不一样。鼓藻也是单细胞体，由2个“半细胞”和中间窄的藻腰组成。生殖方式与新月藻类相同。它们都属于绿藻。大多数可作食用或饲料。绿藻向大自然释放出大量的氧气并含有大量的蛋白质，绿藻对水体自净和工业上都有相当大的作用。
现有技术如授权公告号为cn102020705b的中国发明专利，公开了一种螺旋藻分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)螺旋藻细胞破碎脱色脱腥脱脂物料的制备；(2)稀盐溶液提取蛋白与离心处理；(3)ph梯度分段调酸沉淀蛋白与调节中性；(4)超高温瞬时灭菌和喷雾干燥。应用该方法生产出的螺旋藻分离蛋白具有色泽浅、腥味淡、蛋白质含量高、溶解性好和易消化的优点，可作为一种优质全价蛋白质营养补充剂或添加剂应用，但是该制备方法采用超微粉碎处理进行细胞破碎，破碎不彻底。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种活性蛋白纯度高、得率高，工艺简单有效，生产成本低，产量大，适合大规模制备的新月藻活性蛋白的制备方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：新月藻活性蛋白的制备方法，包括粗细胞破碎、盐析、双水相萃取、超滤，具体包括以下步骤：
细胞破碎：配置含水率为96-98%的藻液，加入功能蛋白肽，选用浓度为0.5-1%的pbs缓冲液作为提取溶剂，在均质压力为23-26mpa条件下均质2-3次，保证每次从均质机流出的蛋白混合液的温度≤40℃，然后经3-5℃、7000-9000rpm的低温离心机离心18-22min，上清液即为蛋白粗提液，该步骤中pbs缓冲溶液对蓝藻细胞壁的作用，削弱了细胞壁的强度，从而使细胞壁在匀浆下更容易破碎，另外，pbs缓冲液体系是弱酸性体系，接近生理环境，更利于藻蛋白活性的保持。高压均质机中的新月藻，通过可调高压均质阀，在骤然失压状态下，产生高速剪切冲击现象，强烈的剪切作用使互不相溶的液－液或液－固等材料形成极细的均匀的乳化物态的分散物，高压匀浆破碎新月藻细胞释放藻蛋白，能够批量化破碎藻细胞，利用工业化生产；
盐析：向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4至25-35%饱和度，3-5℃下静止11-13h，然后在3-5℃、4000-6000rpm下离心20-25min，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗；
双水相萃取：将聚乙二醇和无机盐配成ph为5.8-6.5，聚乙二醇浓度为15-17%，无机盐浓度为11-13%的双水相体系，加入盐析沉淀物，磁力搅拌，然后转移至分液漏斗中分层，上相即为蛋白溶液，双水相萃取技术是一种新型的萃取分配技术，其反应条件温和，容易工艺放大，分相时间短，效果好，其中聚乙二醇相为上相，无机盐相为下相，藻蛋白主要分布在聚乙二醇相中；
超滤：将蛋白溶液置于截留分子量为20-40kda超滤离心管中，离心，冷冻干燥，即为新月藻活性蛋白，该步骤可以在不破坏活性蛋白的前提下，能有效去除蛋白溶液中的聚乙二醇，提高了蛋白的浓度并且保证蛋白的纯度不会减小甚至有所增加，该蛋白具有抗炎活性、抗癌活性及提高免疫性，能够清除活性氧，能通过驱除自由基从而表现出抗炎活性，蛋白的促红细胞生成素活性较高，有刺激骨髓造血的功效，可用于动物的饲料或养鱼饵料。
优选的，细胞破碎步骤中功能蛋白肽的加入量为藻粉重量的0.008-0.01%，氨基酸序列为hshsvcvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该蛋白肽上的正电荷与细菌质膜磷脂分子上的负电荷通过静电作用相互吸引而靠近，破坏脂质双分子层原有的有序结构，在细胞膜上形成离子通道，改变新月藻细胞的渗透压，致使细胞内的物质泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率。
优选的，双水相萃取步骤中无机盐为磷酸钾盐、磷酸钠盐、硫酸钠、硫酸钾、酒石酸钾钠中的一种或几种混合。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.本发明提供的新月藻活性蛋白的提取方法，提取出的活性蛋白纯度高、得率高，工艺简单有效，生产成本低，产量大，适合大规模制备新月藻活性蛋白。
2.采用高压均质机进行细胞破碎，在骤然失压状态下，产生高速剪切冲击现象，强烈的剪切作用使互不相溶的液－液或液－固等材料形成极细的均匀的乳化物态的分散物，高压匀浆破碎新月藻细胞释放藻蛋白，能够批量化破碎藻细胞，适用于工业化生产。
3.双水相萃取技术是一种新型的萃取分配技术，其反应条件温和，容易工艺放大，分相时间短，效果好，其中聚乙二醇相为上相，无机盐相为下相，藻蛋白主要分布在聚乙二醇相中。
4.该蛋白具有抗炎活性、抗癌活性及提高免疫性，能够清除活性氧，能通过驱除自由基从而表现出抗炎活性，蛋白的促红细胞生成素活性较高，有刺激骨髓造血的功效，可用于动物的饲料或养鱼饵料。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
新月藻活性蛋白的制备方法，包括粗细胞破碎、盐析、双水相萃取、超滤，具体包括以下步骤：
1）细胞破碎：配置含水率为98%的藻液，加入功能蛋白肽，选用浓度为0.7%的pbs缓冲液作为提取溶剂，在均质压力为25mpa条件下均质3次，保证每次从均质机流出的蛋白混合液的温度≤40℃，然后经4℃、8000rpm的低温离心机离心20min，上清液即为蛋白粗提液，该步骤中pbs缓冲溶液对蓝藻细胞壁的作用，削弱了细胞壁的强度，从而使细胞壁在匀浆下更容易破碎，另外，pbs缓冲液体系是弱酸性体系，接近生理环境，更利于藻蛋白活性的保持。高压均质机中的新月藻，通过可调高压均质阀，在骤然失压状态下，产生高速剪切冲击现象，强烈的剪切作用使互不相溶的液－液或液－固等材料形成极细的均匀的乳化物态的分散物，高压匀浆破碎新月藻细胞释放藻蛋白，能够批量化破碎藻细胞，利用工业化生产；
2）盐析：向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4至32%饱和度，4℃下静止12h，然后在4℃、5000rpm下离心2min，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗；
3）双水相萃取：将聚乙二醇和无机盐配成ph为6，聚乙二醇浓度为16%，无机盐浓度为12%的双水相体系，加入盐析沉淀物，磁力搅拌，然后转移至分液漏斗中分层，上相即为蛋白溶液，双水相萃取技术是一种新型的萃取分配技术，其反应条件温和，容易工艺放大，分相时间短，效果好，其中聚乙二醇相为上相，无机盐相为下相，藻蛋白主要分布在聚乙二醇相中；
4）超滤：将蛋白溶液置于截留分子量为30kda超滤离心管中，离心，冷冻干燥，即为新月藻活性蛋白，该步骤可以在不破坏活性蛋白的前提下，能有效去除蛋白溶液中的聚乙二醇，提高了蛋白的浓度并且保证蛋白的纯度不会减小甚至有所增加，该蛋白具有抗炎活性、抗癌活性及提高免疫性，能够清除活性氧，能通过驱除自由基从而表现出抗炎活性，蛋白的促红细胞生成素活性较高，有刺激骨髓造血的功效，可用于动物的饲料或养鱼饵料。
上述细胞破碎步骤中功能蛋白肽的加入量为藻粉重量的0.01%，氨基酸序列为hshsvcvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该蛋白肽上的正电荷与细菌质膜磷脂分子上的负电荷通过静电作用相互吸引而靠近，破坏脂质双分子层原有的有序结构，在细胞膜上形成离子通道，改变新月藻细胞的渗透压，致使细胞内的物质泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率。
上述双水相萃取步骤中无机盐为磷酸钾盐、磷酸钠盐、硫酸钠、硫酸钾、酒石酸钾钠中的一种或几种混合。
实施例2：
新月藻活性蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：
1）配置含水率为976-98%的藻液，加入重量为藻粉重量的0.01%的功能蛋白肽，选用浓度为0.8%的pbs缓冲液作为提取溶剂，在均质压力为26mpa条件下均质2次，保证每次从均质机流出的蛋白混合液的温度≤40℃，然后经5℃、9000rpm的低温离心机离心18min，上清液即为蛋白粗提液，该步骤中pbs缓冲溶液对蓝藻细胞壁的作用，削弱了细胞壁的强度，从而使细胞壁在匀浆下更容易破碎，另外，pbs缓冲液体系是弱酸性体系，接近生理环境，更利于藻蛋白活性的保持。高压均质机中的新月藻，通过可调高压均质阀，在骤然失压状态下，产生高速剪切冲击现象，强烈的剪切作用使互不相溶的液－液或液－固等材料形成极细的均匀的乳化物态的分散物，高压匀浆破碎新月藻细胞释放藻蛋白，能够批量化破碎藻细胞，利用工业化生产；
2）向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4至35%饱和度，5℃下静止11h，然后离心，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗；
3）双水相萃取：将聚乙二醇和磷酸钾盐配成ph为6.5，聚乙二醇浓度为15%，无磷酸钾浓度为13%的双水相体系，加入盐析沉淀物，磁力搅拌，然后转移至分液漏斗中分层，上相即为蛋白溶液，双水相萃取技术是一种新型的萃取分配技术，其反应条件温和，容易工艺放大，分相时间短，效果好，其中聚乙二醇相为上相，无机盐相为下相，藻蛋白主要分布在聚乙二醇相中；
4）将蛋白溶液置于截留分子量为40kda超滤离心管中，离心，冷冻干燥，即为新月藻活性蛋白，该步骤可以在不破坏活性蛋白的前提下，能有效去除蛋白溶液中的聚乙二醇，提高了蛋白的浓度并且保证蛋白的纯度不会减小甚至有所增加，该蛋白具有抗炎活性、抗癌活性及提高免疫性，能够清除活性氧，能通过驱除自由基从而表现出抗炎活性，蛋白的促红细胞生成素活性较高，有刺激骨髓造血的功效，可用于动物的饲料或养鱼饵料。
实施例3：
新月藻活性蛋白的制备方法，具体步骤为：配置含水率为96-98%的藻液，加入功能蛋白肽，选用浓度为1%的pbs缓冲液作为提取溶剂，在均质压力为24mpa条件下均质3次，然后经低温离心机离心；向上清液中加入(nh4)2so4至30%饱和度，静止，离心，即得盐析沉淀物；将聚乙二醇和酒石酸钾钠配成ph为6.5、聚乙二醇浓度为17%、酒石酸钾钠浓度为11%的双水相体系，加入盐析沉淀物，磁力搅拌，然后转移至分液漏斗中分层，上相即为蛋白溶液；将蛋白溶液置于截留分子量为20-40kda超滤离心管中，离心，冷冻干燥，即为新月藻活性蛋白。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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