获得高活性Cry1Ai蛋白突变体的方法及其突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种获得高活性CrylAi蛋白突变体的方 法，以及采用该方法获得的高活性的CrylAi蛋白突变体。
【背景技术】
[0002] crylAi基因为本申请人于2009年所克隆（专利号：ZL200910241558. 8 ;束 长龙等，2013)，其表达产物对亚洲玉米螟（Ostriniafurnacalis)、小菜蛾（Plutella xylostella)、水稻二化螟（Chilosuppressalis)、美国白蛾（Hyphantriacunea)及家香 (Bombyxmori)等鳞翅目昆虫具有较好的杀虫活性，但对棉铃虫（Helicoverpaarmigera) 仅具有体重抑制作用，在某种程度上限制了crylAi基因的应用范围。crylAhl(专利号： ZL200410009918. 9 ;张杰等，2006)，其编码的CrylAh蛋白对棉铃虫、亚洲玉米螟和水稻二 化螟等鳞翅目害虫具有很高的毒杀活性，而CrylAh蛋白对重要的经济昆虫家蚕却表现出 较低的生物活性，显示出良好的环境安全性。CrylAh蛋白和CrylAi蛋白活性区域的氨 基酸相似性为84%，两者DomainIII完全一致，DomainI的差异集中定位在helixα-3、 helixα-4和helixα-6上，在DomainII的差异主要集中在loop2和loop3上。
[0003] 近年来大量的研究表明，Cry蛋白上某些氨基酸位点或区域与杀虫特异性有关。 DomainII是Cry毒素结构中变化最多的结构域。主要是顶端的环（loop)，其长度、构象和 序列都可以有很大的变化。CrylA、Cry2A、Cry3A、Cry4A和Cry5A顶端loop的长度变化较 大，Cry5A的loop最长，Cry3A的loop最短，由于DomainII的多变性，该区域被认为是与 Cry毒素作用的特异性有关。研究发现：CrylAb蛋白的loop2上某些氨基酸与其对烟草 天蛾的活性有关；Cry4Ba蛋白的loopα-8参与其与埃及伊蚊（Aedesaegypti)的结合过 程；CryllBa蛋白的loopsα-8、1和3参与受体结合，并与对伊蚊的杀虫活性有关。Cryl9Aa 蛋白的loop1中357W与其对尖音库蚊（Culexpipiens)的活性有关，loop2中的410Y、 416W、418D与其对尖音库蚊和埃及伊蚊的活性有关。但也有研究发现：Cry4Aa蛋白对尖音 库蚊的活性相关区域不是DomainII的loops，可能是DomainIII的某个位点。上述研究 结果充分说明了Cry蛋白的loop区域与其杀虫活性有着密不可分的关系，但Cry类蛋白对 棉铃虫杀虫特异性相关氨基酸区域尚无明确报道，且多数突变体为单点突变且活性大多丧 失，是反面推测该位点可能与杀虫特异性相关的位点，而改变杀虫特异性、提高新活的成功 案例较少。
【发明内容】
[0004] 针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种获得高活性Cry蛋白突变体的方法，采 用多点连续突变的方法，得到了高活性的蛋白突变体。
[0005] 本发明采用该方法，对CrylAi蛋白进行突变，获得的两个突变体，该两个突变体 对某些鳞翅目害虫有毒杀效果有明显的提高。
[0006] 获得高活性Cry蛋白突变体的方法，对Cry蛋白立体结构DomainII的1οορ2或/ 和1〇〇ρ3中的氨基酸序列进行连续多点突变，所述连续多点突变为连续10个以上的氨基酸 序列的改变。
[0007] 所述Cry蛋白为CrylAi或CrylAh蛋白。
[0008] 所述突变为CrylAi蛋白loop2或/和loop3中氨基酸序列突变。
[0009] 所述突变为CrylAi突变体蛋白loop 2中的369RPFNIGINNQQ3?序列突变，或/和 CrylAi突变体蛋白loop 3中的435SMFRSGSSSSVSIIR449序列突变。
[0010] 上述方法得到的蛋白突变体。
[0011] 所述蛋白突变体的氨基酸序列为SEQIDN0:2或SEQIDN0:4。
[0012] 编码上述蛋白突变体的基因。
[0013] 所述基因的序列分别为SEQIDN0:1或SEQIDN0:3。
[0014] 本发明明确了CrylAh蛋白与棉铃虫ΑΡΝΙ片段H3的结合区域是loop2和loop 3的基础上，在比对分析CrylAh蛋白和CrylAi蛋白DomainII中4个loop的差异后，将 CrylAi蛋白的loop2和loop3进行连续多点氨基酸突变（10个氨基酸序列以上），增强 其与受体的结合能力，以提尚杀虫毒力。
[0015] 本发明连续多点突变体ModCrylAid-loop2对棉铃虫的杀虫活性提高了约13倍； 连续多点突变体ModCrylAi-loop2对玉米螟的活性比改造前的CrylAi蛋白提高了近9 倍；连续多点突变体ModCrylAi-loop2和连续多点突变体ModCrylAi-loop3对水稻二化 螟的活性比改造前的CrylAi蛋白提高5倍-6倍左右。
【附图说明】
[0016] 图1反向PCR示意图，
[0017] 图2Western Blot分析CrylAh蛋白的标记情况，
[0018] 图3 SDS-PAGE分析ΑΡΝΙ片段的表达情况，
[0019] 图4棉铃虫ΑΡΝΙ结合区域的鉴定，
[0020] 图5CrylAh蛋白上受体结合区域的鉴定，
[0021] 其中A:饱和结合浓度筛选；B:loop多肽竞争结合；C:loop多肽组合竞结合，
[0022] 图6CrylAh蛋白和CrylAi蛋白DomainII中loop区域对应的氨基酸，
[0023] 图7反向PCR扩增构建连续多点突变体，
[0024]其中M :marker ; 1 :modcrylAi_loop 2 ;2 :modcrylAi_loop 3，
[0025] 图8 TG1中阳性克隆的PCR鉴定结果，
[0026] 图9Rosetta(DE3)中阳性克隆的PCR鉴定结果，
[0027] 1，2 :modcrylAi_loop 2 ;3,4 :modcrylAi_loop 3，
[0028] 图10 SDS-PAGE分析连续多点突变体蛋白在Rosetta (DE3)的表达情况（包涵体 蛋白），
[0029]其中1 :pEB载体；2 :CrylAi ;3 :ModCrylAi_loop 2 ;4 :ModCrylAi_loop 3。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0031]1.材料与试剂
[0032] 1· 1菌株与质粒
[0033] 实验所用菌株与质粒详见表1，可以对公众发放。
[0034] 表1菌株与质粒
[0035]
[0036] 1.2引物及多肽序列
[0037] 连续多点突变突变体构建的引物如表2所示，多肽序列如表3所示，均由生工生物 工程（上海）股份有限公司合成。
[0038] 表2构建连续多点突变的引物序列
[0039]
[0040] 表3多肽序列
[0041]
[0042] 1.3供试昆虫
[0043] 棉铃虫室内敏感种群标准试虫，由中国农科院植保所棉花害虫组提供。
[0044] 亚洲玉米螟室内敏感种群标准试虫，由中国农科院植保所玉米害虫组提供
[0045] 水稻二化螟室内敏感种群标准试虫，由中国农科院植保所水稻害虫组提供
[0046] 1. 4酶与生化试剂
[0047] Primer star高保真扩增酶、限制性内切酶、连接试剂盒BKL试剂盒购自TaKaRa公 司；PCR纯化试剂盒、DNA胶回收试剂以及质粒提取试剂盒购自Axygen公司；Taq Mix聚合 酶购自北京博迈德科技发展有限公司；蛋白Marker购自Bio-Rad公司；DNA marker TaKaRa 公司；抗生素购自鼎国生物工程公司；
[0048] 其它试剂均为市售国产或者进口分析纯或电泳级纯化学试剂。
[0049]蛋白高分子量标准：Protein Standard (High range) (kDa) :200、116、97、66、45
[0050] DL5000DNA Marker (bps) :5000、3000、2000、1500、1000、750、500、200、100
[0051] DL15000DNA Marker(bps) : 15000、10000、7500、5000、2500、1000、250
[0052] 1. 5培养基与抗生素
[0053]液体LB培养基：trytone 1 %，yeast extract 0· 5%，NaCl 1%，pH 7· 0， 121°C /20mim灭菌。
[0054] 固体LB培养基：在液体培养基中加入1. 3%琼脂，121 °C /20mim灭菌。
[0055]液体 1/2LB培养基：trytone0· 5 %，yeastextract0· 25 %，NaCl0· 5 %，pH 7. 0,121°C/20mim灭菌。
[0056] 抗生素：氨苄青霉素水溶液lOOmg/mL用时稀释1000倍；红霉素乙醇溶液6mg/mL， 使用时稀释1000倍；氯霉素乙醇溶液34mg/mL，使用时稀释1000倍，-20°c保存
[0057] 1. 6其它试剂
[0058] (1) 4.Omol/L醋酸钠-醋酸缓冲液
[0059]无水NaAc 65. 61g
[0060] 少量超纯水溶解NaAc，用HAc将pH调至4· 5,再定容至200mL
[0061] (2) 50mM Na2C03
[0062]无水Na2C03 5. 30g
[0063] 超纯水定容至1000mL，121°C /20mim灭菌后，pH调至9·5
[0064] (3) 1. 0mol/L NaCl
[0065] NaCl 58. 44g
[0066] 超纯水定容至1000mL，121°C /20mim灭菌
[0067] (4) 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺
[0068] 丙烯酰胺29. 2g
[0069] 甲叉双丙烯酰胺0.8g
[0070] 超纯水配制100mL，4°C保存
[0071] (5) SDS-PAGE 3X上样缓冲液
[0072] S.DS. 6.0 g 甘袖 30.0niL Tris 3.63 g β-疏基乙廊.. 15^0mL 溴酉分蓝 0 30g
[0073] 超纯水定容至100mL
[0074] (6)电泳缓冲液
[0075] SDS 1. 00g
[0076]甘氨酸14. 4g
[0077] Tris 3. 03g
[0078] 超纯水定容至1000mL，4°C保存
[0079] (7)分离胶缓冲液
[0080]