与昆虫肠蛋白结合的抗体和其应用的制作方法

专利名称：与昆虫肠蛋白结合的抗体和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及能与昆虫肠蛋白结合的抗体和其应用，特别是它们在形成新杂合毒素分子中的应用。本发明还涉及分别产生所述抗体和杂合毒素的微生物、植物细胞和植物。本发明还包括杀昆虫组合物和其保护植物抗虫害的用途。
只有在有限的情形下可以通过生物分子防治各种害虫。具有杀虫作用的生物分子最熟知的例子是来自苏云金芽孢杆菌(Bt)的δ-内毒素。已知许多Bt菌株在孢子形成过程中产生杀虫蛋白δ-内毒素。这些δ-内毒素中有些对不同的害虫有有效的杀虫活性。但是δ-内毒素的应用有限，因为它们的活性仅限于众多害虫中的很小一部分。
Bt内毒素的有限特异性至少部分依赖于毒素在昆虫肠中的活化(Haider，M.Z.等，1986，欧洲生物化学杂志156531-540)和其与昆虫中肠表皮细胞上特异受体结合的能力(Hofman，CP.等，1988，PNAS 857844-7848)。妨碍有些Btδ-内毒素对特异昆虫活性的因素之一是在昆虫肠中缺少适当的受体或δ-内毒素与可能存在的受体缺乏亲和性，从而造成δ-内毒素不能与刷状缘膜结合。因此现在用Bt内毒素防治具体害虫的能力依赖于发现具有理想活性范围的适当δ-内毒素的能力。许多情形下这种δ-内毒素是未知的，甚至不一定存在。例如，针对玉米根叶甲(WCRW，玉米的主要害虫)的活性已筛选了几千株Bt，但至今还没有关于产生对WCRW有高活性的δ-内毒素的Bt菌株的报道。
单一的δ-内毒素一般活性谱很窄，每种只对一种或少数几种害虫有活性。而且已知δ-内毒素只对少数目别的少数昆虫有活性。产生其他具有特异杀虫活性的蛋白的能力，为用对非靶标生物高度安全的生物分子防治农业害虫特别是昆虫提供了更多的选择。因而需要能被设计成靶向特异害虫的结合蛋白。
因而，本发明涉及与昆虫肠的刷状缘膜小泡结合的抗体，特别是单克隆抗体或其片段，和编码这些蛋白的基因。本发明的抗体与靶昆虫肠中的蛋白结合，特别是对选自以下目的靶昆虫鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目和毛翅目，但不与哺乳动物的刷状缘膜或与植物的微粒体结合。本发明特别涉及与玉米根叶甲的肠结合的单克隆抗体或片段。在一优选的实施方案中，本发明涉及选自下组的单克隆抗体2B5、3B1、10B6、17F6、14G1和16E4。
本发明还包括产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞，特别是已按下列保藏号保藏的杂交瘤细胞ATCC HB 11616，HB 11617，HB 11618，HB11619和HB 11620。
本发明的另一个目的是提供编码本发明单克隆抗体或所述单克隆抗体的结合位点的DNA序列。本发明特别涉及编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列，其中所述DNA片段选自SEQ ID No.1，3，5，7，9，11，13，15，17，44或46。还包括这样的DNA序列，所述DNA序列与毒素部分有效地连接，特别是其中所述毒素片段选自芽孢杆菌毒素、假单胞菌内毒素、商陆素、gelonin、核糖核酸酶或核糖体灭活蛋白。
这些抗体和编码它们的基因可用于构建防治害虫的杂合毒素。因而，本发明的另一方面是包括本发明单克隆抗体或单克隆抗体片段和与其有效连接的毒素部分的杂合毒素分子。在本发明的一个优选实施方案中，所述毒素部分选自芽孢杆菌毒素如芽孢杆菌内毒素，特别是选自下组Bt内毒素、营养期杀虫蛋白、假单胞菌内毒素、商陆素、gelonin、核糖核酸酶或核糖体灭活蛋白。
本发明从而还涉及包括与靶昆虫的肠特别是与昆虫刷状缘膜结合、但不与哺乳动物刷状缘膜或植物微粒体结合的单克隆抗体或其结合区域和与其有效地结合的毒素部分的杂合毒素，其中毒素部分选自芽孢杆菌毒素如芽孢杆菌内毒素，特别是选自下组Bt内毒素、营养期杀虫蛋白、假单胞菌内毒素、商陆素、gelonin、核糖核酸酶或核糖体灭活蛋白。
本发明还包括编码本发明杂合毒素的DNA序列，所述杂合毒素包括与靶昆虫的肠结合但不与哺乳动物刷状缘膜或植物微粒体结合的单克隆抗体或其结合区域和与其有效地连接的毒素部分。
本发明进一步包括用其中插入编码本发明杂合毒素的DNA分子的适当载体转化的微生物宿主。这些微生物宿主特别包括细菌、藻类和真菌。
本发明进一步包括用至少一种本发明的DNA序列转化的重组微生物，特别是选自下组的微生物细菌如芽孢杆菌、柄杆菌、Agmenellum、假单胞菌、欧文氏菌、沙雷氏菌、科雷伯氏菌、黄单胞菌、链霉菌、根瘤菌、红假单胞菌、Metylius、农杆菌、醋杆菌、乳杆菌、节杆菌、固氮菌、明串珠菌和产碱菌；真菌特别是酵母如酵母、隐球酵母、克鲁维酵母、掷孢酵母、红酵母和短梗霉；病毒如苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒。
本发明特别涉及包含至少一种编码杂合毒素的DNA分子的重组微生物，其中杂合毒素包括与靶昆虫的肠结合但不与哺乳动物刷状缘膜或植物微粒体结合的抗体或其片段和与其有效地连接的毒素部分，所述编码单克隆抗体的DNA序列选自SEQ ID No.1，3，5，7，9，11，13，15，17，44或46。
本发明进一步包括含有杀虫有效量的本发明的任何上述重组微生物和适当载体的杀虫组合物。
本发明特别涉及含有杀虫有效量的本发明的分离的杂合毒素分子和适当载体的杀虫组合物。
本发明进一步涉及由第一表达盒组成的DNA序列，该表达盒包括编码能够指导在植物中表达的启动子的DNA序列，和与其有效连接的编码与靶昆虫的肠结合的单克隆抗体轻链或抗体结合域的第一DNA序列。在一优选实施方案中，所述表达盒进一步包括与所述编码单克隆抗体轻链或抗体结合域的第一DNA序列有效连接的编码毒素部分的第二DNA序列。特别优选的表达盒中第二DNA序列编码的毒素部分选自芽孢杆菌毒素、假单胞菌内毒素、商陆素、gelonin、核糖核酸酶或核糖体灭活蛋白。
本发明进一步包括含有第二表达盒的DNA序列，该第二表达盒中有编码能够指导在植物中表达的启动子的DNA序列，并与编码与靶昆虫肠结合的单克隆抗体重链或抗体结合域的第一DNA序列有效地连接。在另一实施方案中，所述表达盒进一步包括与所述编码单克隆抗体重链或抗体结合域的第一DNA序列有效连接的编码毒素部分的第二DNA序列。特别优选的表达盒中第二DNA序列编码的毒素部分选自芽孢杆菌毒素、假单胞菌内毒素、商陆素、gelonin、核糖核酸酶或核糖体灭活蛋白。
本发明的DNA序列可以是分离的基本纯化的形式或作为植物基因组的一部分。
本发明进一步涉及植物细胞或植物，包括其后代，特别是玉米植物，该植物细胞或植物已用本发明的DNA序列特别是本发明的植物表达盒进行了转化。本发明还包括能以使植物和植物细胞分别耐受或抵抗害虫的量表达本发明杂合毒素的转基因植物细胞或转基因植物，包括其后代，特别是玉米植物。本发明的植物优选为杂种植物。
本发明还包括经保护剂包衣处理的植物繁殖体，特别是植物种子。
本发明还涉及产生本发明抗体或单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备方法，其包括a)用昆虫肠，特别是昆虫刷状缘膜作为抗原；b)用所述抗原免疫供体动物；c)从被免疫的供体动物分离免疫成分B细胞；d)将所述免疫成分B细胞与能进行连续细胞分裂的肿瘤细胞融合；e)分离形成的融合产物，在适当的培养基中培养，然后克隆阳性杂合细胞；和f)将克隆的杂合细胞按产生单克隆抗体的能力进行筛选，选择具有所要求性质的克隆。
本发明还涉及产生能与昆虫肠刷状缘膜小泡结合的抗体、尤其是单克隆抗体或其片段的方法，包括使产生所述抗体的杂交瘤细胞在适当的培养基中体内或体外生长，及分离生产的抗体。
本发明还涉及产生能与昆虫肠刷状缘膜小泡结合的杂合毒素的方法，所述杂合毒素包括本发明的单克隆抗体或单克隆抗体结合片段和与其有效连接的毒素部分，该方法包括克隆所述抗体的可变区并将所述可变区与毒素部分连接。
本发明进一步包括编码本发明单克隆抗体的DNA的制备方法，其包括用针对恒定区保守DNA序列和可变区的支架区的引物，从杂交瘤细胞克隆相应的抗体基因。
本发明还包括产生转基因植物细胞和转基因植物的方法，分别包括用一种或多种上述编码本发明杂合毒素的DNA序列转化所述植物细胞或植物，所述杂合毒素包括与靶昆虫的肠结合而不与哺乳动物的刷状缘膜或植物微粒体结合的单克隆抗体或其结合域和与其有效结合的毒素部分。
本发明提供了对抗昆虫肠中蛋白的抗体和单克隆抗体，包括其能够以该抗体或单克隆抗体的特异性结合的片段。这种抗体与昆虫肠细胞结合，但不与哺乳动物刷状缘膜小泡(BBMV)结合，也不与植物微粒体结合。
本发明的抗体包括单克隆抗体和其保留与昆虫肠蛋白结合能力的片段。如果一种抗体、单克隆抗体或其片段能够与一分子特异地反应，从而将该分子结合到抗体上，则可以说该抗体能够与该分子结合。术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意指完整的分子以及其能够结合半抗原的片段或结合区或域(例如包括Fab和F(ab)2片段)。这种片段一般是通过用蛋白酶裂解产生的，例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶。或者，半抗原结合片段可以通过应用重组DNA技术或通过合成化学来产生。
制备本发明抗体的方法总体上是已知的。例如，见抗体实验室手册，EdHarlow和Lane编，冷泉港实验室，纽约(1988)，及其中所引用的文献。关于免疫学一般原理的标准参考著作包括Klein，免疫学杂志细胞-非细胞判别的科学，John Wiley&Sons，纽约(1982)；Dennett，R.等.单克隆抗体，杂交瘤生物分析中的新手段，Plenum出版社，纽约(1980)；和生物化学和分子生物学的实验室技术，13卷，Burdon等编，Elsevier，Amsterdam(1984)中Campbell，A.的”“单克隆抗体技术”。还可参见美国专利4,609,893；4,713,325；4,714,681；4,716,111；4,716,117和4,720,459。
可以利用昆虫肠特别是昆虫刷状缘膜作为抗原制备本发明的抗体和单克隆抗体。这种昆虫肠膜可以通过本领域的已知方法来制备。一般，刷状缘膜可以这样制备从昆虫幼虫切下肠并匀化，然后用氯化钙沉淀膜。例如见，Wolfrsberger(1986)化合物-生物化学-生理学86A301-308。
可以认识到，利用本文描述的方法可以制备对具体靶昆虫特异的抗体。靶昆虫意指本发明抗体与其肠中蛋白结合的昆虫。也就是说，可以制备能够结合只在靶昆虫中存在的蛋白的抗体。
靶昆虫可以是任何昆虫，包括选自下列各目的昆虫鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目和毛翅目等。因此可以选择任何昆虫害虫，并制备对该昆虫特异的抗体。尤其有意义的昆虫是没有Bt蛋白与其结合并将其杀死的那些，如玉米根叶甲。
本发明产生抗体和单克隆抗体的细胞系是当用昆虫刷状缘膜小泡作为抗原产生Mab系时所产生的所有单克隆抗体中的一部分。产生理想单克隆抗体的细胞系的结合特征是通过对所有针对靶昆虫BBMV的各种单克隆抗体进行区别筛选而确定的。
本发明的区别筛选能鉴别出与哺乳动物BBMV和/或植物微粒体结合的抗体系。弃去与哺乳动物BBMV和/或植物微粒体结合的单克隆抗体细胞系。区别筛选还能鉴别出与非靶昆虫种别的昆虫BBMV结合的单克隆抗体细胞系。因此，本发明的抗体是只对靶昆虫特别是靶昆虫的肠显示高特异性结合的那些抗体。
具有理想结合特异性的MAb亚系可以用作克隆特异单克隆抗体cDNA的信使RNA源。利用针对恒定区保守DNA序列和可变区的支架区的引物可从杂交瘤细胞克隆抗体基因。然后利用聚合酶链反应(PCR)扩增克隆的DNA。已成功地利用了Kabat等收集的小鼠重链和轻链序列数据库来产生用于抗体基因克隆的同型特异性引物和降解引物(Kabat，E.A.等，1987，美国健康和人体事物部，美国政府出版局，和Jhons，S.T.和Bendig，M.，1991，生物技术988-89)。另外，已知许多关于克隆具有原始抗体结合特性的抗体小片段的技术。
克隆的DNA然后可以用本领域的已知方法测序。例如见，Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约(1989)，1-3卷，和其中引用的文献。从核苷酸序列可以推定所选单克隆抗体的结合区的蛋白序列。
本发明的抗体和单克隆抗体可用于产生杂合毒素分子。“杂合毒素分子”或“杂合毒素”意指包括单克隆抗体或抗体片段和与其有效结合的毒素部分并能够与昆虫的肠结合的融合蛋白或免疫毒素。即，当结合在一起时，单克隆抗体或抗体片段保持其结合特性，毒素部分保持其细胞毒特性。
可以用许多细胞毒性蛋白作为毒素部分。这包括但不限于芽孢杆菌毒素，包括内毒素和营养期杀虫蛋白。例如见1993年3月25日申请的美国申请08/037,057和WO93/07278，将其并入本文作为参考。其他毒素包括催化性核糖体灭活剂如gelonin、假单胞菌内毒素A或商陆素(假单胞菌内毒素的结构已被鉴定，Chaudhary等，(1990)生物化学杂志26516303-16310)；细胞代谢阻断剂如核糖核酸酶(例如见Mariani(1990)自然347737-741)；Barnase毒素(或PE-Bar)，一种由假单胞菌内毒素A和核糖核酸酶衍生的嵌合毒素(见Prior等(1991)细胞641017-1023)；在膜中能造成孔的亲水性蛋白(见Frohlich和Wells(1991)肽蛋白研究国际杂志372-6)等。
因此，本发明的杂合毒素分子含有使该分子与昆虫肠结合的区域(抗体区)和实施杀死靶细胞并最终杀死靶昆虫的毒性区。通过杂合毒素中的单克隆抗体或其片段，杂合毒素与靶昆虫的肠结合，从而只对该昆虫起毒性作用。这种杂合毒素的结合特征来自单克隆抗体的结合区，而这种杂合毒素的毒性效应来自所用的毒素部分。
连接抗体或抗体片段和毒素的方法是本领域已知的。这种方法包括用于单链抗体免疫毒素的接头(Chandhary等(1989)自然339394-397；Chardhary等(1990)PNAS 879491-9494；Batra等1991，分子和细胞生物学112200-2205；Brinkmann等(1991)，PNAS 888616-8620；Brinkma等(1992)PNAS 893075-3079；Whitlow等(1993)，蛋白工程6989-995)。一种特别有用的接头基于人IgAl铰链区，见Hallewell等(1989)，生物化学杂志2645260-5268并如SEQ ID NO43中所述。
杂合毒素的活性可能取决于几种因素，可以优化这些因素。可以使用暂时表达的玉米原生质体产生的蛋白测定该活性。按此方法，将表达杂合毒素的玉米原生质体搀入昆虫食物中进行活性测定。一般的昆虫测定方法见Marrone(1985)，经济昆虫学.78290-293，Maclntosh等(1990)，无脊椎动物病理杂志56258-266和其中所引用的文献。
这样就可以测试杂合毒素分子对靶昆虫的杀虫活性。那些显示活性的分子可进一步开发以供农业应用。
还可以认识到可以构建各种不同的杂合毒素分子。例如，杂合毒素可以由分别编码抗体分子重链和轻链的两个表达盒来编码。例如这种二元杂合毒素可以利用细胞的正常加工机制进行体内组装，以产生抗体结合位点。杂合毒素的毒素部分可以有效地连接在轻链或重链的N或C末端，或者置于两种链恒定区的任何部分。毒素部分也可以插入在抗体链的恒定区中或两个恒定区之间。这种分子可用标准的分子技术制得。例如见Sambrook等.分子生物学实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约(1989)1-3卷，和其中引用的文献。
可以在植物中产生本发明的杂合毒素，包括二元毒素。按此方法，以能够组装功能抗体的方法在植物中克隆和表达抗体基因。例如见Hiatt等(1989)自然34276-78，During等(1990)，植物分子生物学杂志15281-293和PCT申请WO91/06320。据报道二价抗体的表达水平高达烟草中可溶蛋白的1％。认为可以使用抗体分子或抗体片段如Fab和Fv片段。已证明较小的Fab和Fv片段(12kDa-50kDa)完全保持了结合亲和力。其中Vh和VI区由一亲水柔性肽连接的单链Fv片段已成功地用于靶酶，并对特异细胞有毒性(Bird(1988)科学423423-426和Huston(1988)PNAS 855879-5883)。小至20个氨基酸称为最小识别单位(mru)的单链Vh区(Dab)和单链互补决定区也用于抗原结合(Ward(1989)自然341544-546和Taub(1989)，生物和化学杂志.264259-265和Willams(1989)PNAS 865537-5541)。这些抗体片段的应用提供了将来自单克隆抗体的昆虫特异结合区缩小到很小的可能性。编码能与昆虫肠结合的抗体或抗体区的DNA片段也包括在本发明范围内。在一优选实施方案中，这些DNA片段编码单克隆抗体的结合区，该单克隆抗体是针对靶昆虫的BBMV的，并经筛选保证不与哺乳动物的BBMV或植物微粒体结合。这种DNA片段可用于构建编码上述新杂合毒素分子的基因。
编码杂合毒素分子毒素部分的DNA序列是本领域已知的。见Lamb等(1995)欧洲生物化学杂志.148275-170(蓖麻毒)；Gray等(1984)PNAS812645-2649(假单胞菌毒素DNA序列)；Hindley和Berry(1988)核酸研究.164168(B.sphaericus毒素基因)；Bauman等(1988)，细菌学杂志.1702045-2050，Baumann等(1987)，细菌学杂志.1694061-4067，Berry和Hindley(1987)核酸研究.155891，Berry等(1989)，核酸研究.177516(B.sphaericus)；WO 9309130-A(gelonin)；EP466222-A，U.S.Patent No.5,128,460(核糖体活化蛋白)；EP 412911-A(barnase)；Heernstadt等(1987)基因5737-46(cryIIIA)；Brizzard和Whiteley(1988)核酸研究162723-2724(cryIB)；和Geiser等(1986)基因48109-118(cryIA(b))。也见于Porter等(1993)，微生物学综述57838-861；Hofte和Whiteley(1989)微生物学综述53242-255；和WO 93/07278。
可以优化本发明的杂合毒素基因以提高在植物中的表达。例如见WO93/07278；EPA 0359472；EPA 0385962；WO91/16432；Perlak等(1991)，美国全国学院科学进展.883324-3328；和Murray(1989)核酸研究17477-498。按此方法，可以用植物优选的密码子合成该基因。特异宿主的优选密码子是在该宿主中最常用来编码氨基酸的单一密码子。对于具体氨基酸，玉米的优选密码子来自玉米的已知基因序列。玉米植物的28种基因的密码子选用见于Murray(1989)核酸研究17477-498，其公开内容并入本文作为参考。还可以基于特异宿主对特异氨基酸使用的密码子分布来合成基因。
按照该方法可以为在任何植物中的表达优化核苷酸序列。认为可以优化或合成所有基因序列或其任何部分。也就是说可以使用合成的、部分优化的或天然的序列。
转化植物细胞的方法和繁殖被转化植物的方法是本领域内熟知的。为了将外源DNA引入植物，使用了Ti质粒载体以及直接DNA吸入法、脂质体法、电穿孔法、微注射法和使用微发射物的方法。这些方法已被公开在下列文献中，例如Guerche等，(1987)植物科学52111-116；Neuhause等，(1987)理论和应用遗传学。7530-36’；Klein等，(1987)自然32770-73；Howell等，(1980)科学2081265；Horsch等，(1985)科学2271229-1231；DeBlock等，(1989)植物生理学91694-701；植物分子生物学方法(Weissbach和Weissbach编)学院出版社(1988)；和植物分子生物学方法(Schuler和Zielinski编)学院出版社(1989)。也见于EPA 0193259和EPA0451878A1。可以理解转化方法将取决于待转化的植物细胞。
还可以修饰含有目标序列的表达盒中的成分以提高在植物和植物细胞中的表达。例如可以使用截短序列、核苷酸取代或其他修饰办法。例如见Perlak等(1991)美国全国学院科学进展883324-3328；Murray等(1989)核酸研究17477-498；和WO 91/16432。
该结构中还可以包括任何其他必须的调节序列，如终止子(Guerineau等，(1991)，分子和普通遗传学，226141-144；Proudfoot，(1991)，细胞，64671-674；Sanfacon等，(1991).基因进展，5141-149；Mogen等，(1990)，植物细胞，21261-1272；Munroe等(1990)，基因，91151-158；Ballas等(1989)，核酸研究，177891-7903；Joshi等(1987)，核酸研究，159627-9639)；植物翻译保守序列(Joshi，C.P.，(1987)，核酸研究，156643-6653)，内含子(Luehrsen和Walbot，(1991)，分子和普通遗传学，22581-93)等，它们与核苷酸序列有效地连接。在表达盒结构中包含5’引导序列是有益的。这种引导序列可以起到增强翻译的作用。翻译引导序列在本领域中是已知的，包括细小核糖核酸病毒引导序列，例如EMCV引导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，和Moss，B.(1989)PNAS美国866126-6130)；Potyvirus引导序列，例如TEV引导序列(烟草Etch病毒)(Allison等(1986)；MDMV引导序列(玉米矮化花叶病毒)；病毒学，154；9-20)，和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，(Macejak，D.G.和Sarnow，P.，(1991)，自然，353；90-94；苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的非翻译引导序列(AMV RNA4)，(Jobling，S.A.和Gehrke，L.，(1987)，自然，325622-625；烟草花叶病毒引导序列(TMV)，(Gallie，D.R.等，(1989)，RNA的分子生物学，237-256页；和玉米矮黄斑驳病毒引导序列(MCMV)(Lommel，S.A.等(1991)，病毒学，81382-385。也见于Della-Cioppa等，(1987)，植物生理学，84965-968。
表达盒中可以使用植物终止子。见Rosenberg等(1987)，基因，56125；Guerineau等(1991)，分子和普通遗传学，226141-144；Proudfoot，(1991)，细胞，64671-674；Sanfacon等，(1991)，基因进展，5141-149；Mogen等，(1990)，植物细胞，21261-1272；Munroe等(1990)，基因，91；151-158；Ballas等(1989)，核酸研究，177891-7903；Joshi等(1987)，核酸研究，159627-9639。
为了进行组织特异性表达，可将本发明的核苷酸序列与组织特异性启动子有效连接。例如见US WO 93/07278，将其并入本文作为参考。
本发明还包括通过上述方法转化的转基因植物，特别是转基因能育植物和其仍含有编码本发明单克隆抗体或杂合毒素的DNA分子的无性和/或有性繁殖后代。从本发明的转化植物材料培育的成熟植物进行自交或远交以产生种子。
本发明的转基因植物可以是双子叶植物或单子叶植物。优选的单子叶植物是禾本科的植物，包括麦属、玉米属、小麦属、Triticale、高粱属、甘蔗属、雀麦属、稻属、燕麦属、大麦属、黑麦属和狗尾草属植物。
特别优选转基因玉米、小麦、大麦、帚蜀黍、黑麦、燕麦、草地草和稻。
本发明特别优选的双子叶植物有大豆、棉花、烟草、甜菜、油耔油菜和向日葵。
“后代”一词应理解为包括转基因植物的“无性”和“有性”繁殖后代。这一定义还包括通过已知方法例如细胞融合或突变选择可获得的、仍显示原转基因植物特征特性的所有突变体和变异体，以及该转基因植物材料的所有杂交和融合产物。
本发明的另一目的是转基因植物的繁殖材料。
转基因植物的繁殖材料在本发明中定义为可以在体内或体外进行有性或无性繁殖的任何植物材料。本发明中特别优选原生质体、细胞、calli、组织、器官、种子、胚、花粉、卵细胞、合子、块茎、谷粒、果实以及可从转基因植物获得的其他繁殖材料。
来自转基因植物的植物部分如花、茎、果、叶、根或其后代也包括在本发明范围内，所述转基因植物按本发明方法进行过转化，因而至少部分由转基因细胞组成。
在植物繁殖材料(果实、块茎、谷粒、种子)特别是种子作为商品出售之前，通常用保护剂包衣材料处理以防止由细菌、真菌和动物害虫造成的损害，所述保护剂包衣材料包括除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或数种这些制剂的混合物，必要时还可以包括载体、表面活性剂或通常用于制剂领域中的应用促进佐剂。
为处理种子，可以通过液体制剂浸泡块茎或谷粒或通过用湿或干混合制剂对其进行包衣而将保护剂施于种子。在特殊情形下也可能使用其他方法，例如直接处理芽或果。
含有编码本发明单克隆抗体或杂合毒素的DNA序列的本发明植物种子可以用种子保护剂包衣材料处理，后者包括种子处理化合物如captan，carboxin，thiram(TMTD)，methalaxyl(Apron)和pirimiphos-methyl(Actellic)和其他常用于种子处理的其他化合物。
本发明的另一目的是提供用常用于种子处理的种子保护剂包衣材料处理过的用于培育植物的植物繁殖材料，尤其是植物种子。
本发明的杂合毒素可用于保护农作物和产品不受害虫侵害。或者可以通过适当的载体将编码杂合毒素的基因引入微生物宿主中，并将该宿主施用于环境或植物或动物。微生物宿主可选自已知占据一种或多种目标作物“植物圈”(叶面、叶围、根际和/或根系)的微生物。选择这些微生物使其在具体环境中能与野生型微生物成功地竞争，稳定地保持并表达多肽杀虫剂的基因，最好是提高对该杀虫剂的保护以抵抗环境降解和灭活。
这种微生物包括细菌、藻类和真菌。特别有意义的微生物例如有细菌如芽孢杆菌、柄杆菌、Agmenellum、假单胞菌、欧文氏菌、沙雷氏菌、科雷伯氏菌、黄单胞菌、链霉菌、根瘤菌、红假单胞菌、Metylius、农杆菌、醋杆菌、乳杆菌、节杆菌、固氮菌、明串珠菌和产碱菌；真菌特别是酵母如酵母、隐球酵母、克鲁维酵母、掷孢酵母、红酵母和短梗霉。特别是下列植物圈细菌种类如丁香假单胞菌、荧光假单胞菌、粘质沙雷氏菌、木醋杆菌、球形红假单胞菌、野油菜黄单胞菌、苜蓿根瘤菌、真养产碱菌、Clavibacter xyli和维涅兰德固氮菌；和植物圈酵母种类，如深红酵母、红酵母、海滨红酵母、橙黄红酵母、浅白隐球酵母、流散隐球酵母、变黄罗伦隐球酵母、罗斯酵母、普地酵母、酿酒酵母、掷孢酵母、香气掷孢酵母、佛地克鲁维酵母和出芽短梗霉。特别是那些产色素微生物。
微生物重组菌株中新型杂合毒素基因的应用示于实施例7中。应该认识到本发明分离的新型杂合毒素基因可以转移到任何微生物宿主中并用该宿主提供其杀虫特性。本发明新型杂合毒素基因的替代宿主的选择要适应以下目的克隆目的，鉴定基因或所编码蛋白的形式和功能的目的，用作发酵宿主以提高杂合毒素蛋白产量的目的，更有效地将至少一种杂合毒素蛋白输送至靶昆虫害虫的目的，或将该新型杂合毒素基因引入昆虫病原体如杆状病毒[一种多核型多角体病毒，如[苜蓿银纹夜蛾病毒]以提高其效力的目的。
可以用本领域所认同的各种方法将新型杂合毒素基因或其重组形式转化至这种替代宿主中。一种优选方法是微生物细胞电穿孔法，如Dower(美国专利5,186,800)中所述。另一种优选方法是Schurter等描述的方法(分子和普通遗传学.218177-181(1989))，这种方法的描述还见于EP-A0342633，其整个内容并入本文作为参考。
预想这种替代宿主可施用于环境、植物或动物以防虫害。微生物宿主可选自已知占据一种或多种目标作物“植物圈”(叶面、叶围、根际和/或根系)的微生物。选择这些微生物使其在具体环境中能与野生型微生物成功地竞争，稳定地保持并表达多肽杀虫剂的基因，最好是提高对该杀虫剂的保护以抵抗环境降解和灭活。
本发明还提供杀虫组合物，其中含有作为活性成分的至少一种本发明新型杂合毒素或含有至少一种重组形式的新毒素基因的重组微生物，以及农用佐剂如载体、稀释剂、表面活性剂或应用促进佐剂。该组合物还可以含有其他生物活性化合物。这种化合物可以是肥料或微营养提供剂或其他影响植物生长的制剂。它还可以是选择性除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂中几种的混合物，适当时还可以包含其他通常用于制剂领域中的农用载体、表面活性剂或应用促进佐剂。适当载体和佐剂可以是固体或液体并相当于制剂技术中通常使用的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增稠剂、粘合剂或肥料。
该组合物可含有0.1-99％(重量)的活性成分，1-99.9％(重量)的固体和液体佐剂，和0-25％(重量)的表面活性剂。包括至少一种本发明的新型杂合毒素或含有至少一种重组形式新毒素基因的重组微生物的活性成分或含有所述活性成分的组合物，可以与某些其他杀虫剂或化学物质一起使用于待保护的植物或作物而不丧失其效力(1993作物保护化学品目录，化学品和药品出版社，加拿大)。可以用粉尘剂、悬浮剂、可温性粉末或其他适于农业应用的任何形式来施用。
本发明还提供控制或抑制昆虫害虫的方法，包括将含至少一种本发明的新型杂合毒素或含有至少一种重组形式新毒素基因的重组微生物的活性成分或含有所述活性成分的组合物施用于(a)该害虫可能存在的环境，(b)植物或植物部分以保护所述植物或植物部分免受害虫的侵害，或(c)种子以保护从所述种子发生的植物免受害虫的侵害。
植物保护方面一种优选的施用方法是施用于植物的叶上(叶施用)，使用数量和频率取决于待保护的植物和目标害虫侵害的机率。但是如果用液体制剂浸润植物栽种地或者将活性成分以固体形式掺入植物栽种地如以颗粒形式掺入土壤中(土壤施用)，活性成分也可以通过根渗透到植物中(系统作用)。对于稻田，可以向浇灌后的稻田中施用定量的这种粒剂。
本发明的组合物还适用于保护植物繁殖材料免受虫害，例如种子如果实、块茎或谷粒，或植物切块。这些繁殖材料在种植前可以用制剂处理例如种子在播种前进行敷裹(dressed)处理。还可以将本发明活性成分施用于谷粒(包衣)，用液体制剂浸泡谷粒或用固体制剂进行包衣。当植物材料进行栽种时还可以将该制剂施用于栽种地，例如播种时用于种子的犁沟中。本发明还涉及处理植物繁殖材料的方法和这样处理后的植物繁殖材料。
含有作为活性成分的含至少一种重组形式新毒素杂合基因的微生物的本发明组合物，可以用任何已知方法用细菌菌株处理种子或土壤。例如见美国专利4,863,866。甚至非活体微生物菌株也可以对害虫防治有效。但优选使用活体微生物。
本发明范围内待保护的靶作物包括，例如下列植物种类谷物(小麦、大麦、黑麦、燕麦、稻、帚蜀黍和相关的作物)，甜菜(甜菜和抹甜菜)，粮草(鸭茅、田边草等)，核果，梨果和软果(苹果、梨、李子、桃子、杏、樱桃、草莓、覆盆子和黑梅)，豆科植物(豆、扁豆、豌豆、大豆)，油料植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生)，瓜类植物(黄瓜、食用葫芦、甜瓜)，纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)，柑橘水果(橘子、柠檬、柚子、橘)，蔬菜(菠菜、莴苣、芦笋、甘蓝和其他芥科植物、洋葱、番茄、马铃薯、干红椒)，月桂科(鳄梨、胡萝卜、肉桂、樟脑)，枫树和针叶树(如菩提树、紫杉树、赤杨、白杨、桦树、枞树、落叶松、松树)，或诸如玉米、烟草、浆果、咖啡、甘蔗、茶、葡萄树、蛇麻草和天然橡胶的植物，以及装饰植物(包括植物组合)。
含有至少一种重组形式新基因的重组微生物一般以杀虫组合物的形式施用，可以与其他生物活性化合物一起同时或相继施用于作物区或待处理的植物。这些化合物可以是肥料或微营养提供剂或其他影响植物生长的制剂。它们还可以是选择性除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂中几种的混合物，适当时还可以包含其他通常用于制剂领域中的农用载体、表面活性剂或应用促进佐剂。
本发明的活性成分可以以原始形式使用或与任何适当的农用载体一起使用。这种载体是通常用于农业制剂领域中的佐剂，从而可以按一种方法配制成可乳化浓液、可包衣浆液、可直接喷雾的或可稀释的溶液、稀乳液、可湿性粉末、可溶性粉末、粉尘剂、粒剂以及包囊制剂，如聚合物包囊。像组合物的性质一样，施用方法如喷雾、喷洒、撒粉、分散或灌注，要根据目标物和分布环境来选择。有利的施用量一般是每公顷(ha，约2.471英亩)约50克-5千克活性成分(a.i.)，优选约100克-2千克活性成分/公顷。重要的施用量是约200克-1千克活性成分/公顷，和200克-500克活性成分/公顷。种子覆裹的有利用量是每100千克种子0.5克-1000克活性成分，优选3克-100克活性成分/100千克种子，或10克-50克活性成分/100千克种子。
适当载体和佐剂可以是固体或液体并相当于制剂技术中通常使用的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增稠剂、粘合剂或肥料。制剂，即包含作为活性成分的含重组形式新基因的重组微生物、或还含其他活性成分、适当时还含有固体或液体佐剂的杀虫组合物、制剂或混合物，按已知方法制备，例如将活性成分与补充剂如溶剂、固体载体和有时使用的表面活性剂混匀和/或研磨。
适当的溶剂是芳香烃，优选含8-12个碳原子的级分，如二甲苯混合物或取代的萘，邻苯二甲酸酯如邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二辛酯，脂肪烃如环己烷或石蜡，醇或二元醇和其醚和酯如乙醇、乙二醇单甲醚或单乙醚，酮如环己酮，强极性溶剂如N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺，以及植物油或环氧化的植物油如环氧化椰子油或豆油；或水。
例如用于粉尘剂和可分散粉末的固体载体一般是天然无机填料，如方解石、滑石、高岭土、蒙脱石或白土。为了改进物理性能还可能加入高分散硅酸或高分散吸附性聚合物。适当的吸附性颗粒载体是多孔型的，例如浮石、碎砖、海泡石、膨润土；和适当的非吸附性载体是诸如方解石和沙子等材料。另外可以使用许多预制粒的无机或有机材料，例如白云石或粉碎的植物残体。
根据要配制的活性成分的性质，适当的表面活性化合物是具有良好的乳化、分散和润湿特性的非离子型、阳离子型和/或阴离子型表面活性剂。“表面活性剂”一词还可以理解为包括表面活性剂混合物，阴离子表面活性剂既可以是水溶性皂也可以是水溶性合成表面活性化合物。适当的皂是高级脂肪酸(C10-C22)的或可从如椰子油或脂油获得的天然脂肪酸混合物的碱金属盐、碱土金属盐或取代或未取代的铵盐。适当的表面活性剂还有脂肪酸甲基牛胆碱盐以及改性或未改性的磷脂。
但更常用的是所谓的合成表面活性剂，尤其是脂肪磺酸盐、脂肪硫酸盐、磺化的苯并咪唑衍生物或烷基芳基磺酸盐。脂肪磺酸盐或脂肪硫酸盐一般是碱金属盐、碱土金属盐或取代或未取代的铵盐形式，一般含有8-22个碳原子的烷基残基，这也包括酰基的烷基部分，例如木素磺酸的、十二烷基硫酸的或从天然脂肪酸得到的脂肪醇硫酸酯混合物的钠盐或钙盐。这些化合物还包括硫酸酯的和磺酸的脂肪醇/环氧乙烷加合物的盐。磺化苯并咪唑衍生物优选含有2个磺酸基团和1个含约8-22个碳原子的脂肪酸残基。烷基芳基磺酸盐的实例有十二烷基苯磺酸的、二丁基萘磺酸的或萘磺酸/甲醛缩合产物的钠盐、钙盐或三乙醇胺盐。相应的磷酸盐也适用，例如对壬基苯酚与4-14摩尔环氧乙烷的加合物磷酸酯的盐。
非离子型表面活性剂优选是脂肪醇或环脂醇的、或饱和或不饱和脂肪酸及烷基苯酚的聚乙二醇衍生物，所述衍生物包含3-30个乙二醇醚基团，烃基部分包含8-20个碳原子，烷基苯酚的烷基部分含6一18个碳原子。
其他非离子型表面活性剂有聚环氧乙烷与聚丙二醇，乙二胺基聚丙二醇和烷基链中含1-10个碳原子的烷基聚丙二醇的水溶性加合物，该加合物含有20-250个乙二醇醚基团和10-100个丙二醇醚基团。这些化合物通常含有1-5个乙二醇单元/丙二醇单元。非离子型表面活性剂的代表性实例是壬基苯酚聚乙氧基乙醇，蓖麻油聚乙二醇醚，聚氧化丙烯/聚氧化乙烯加合物，三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇，聚乙二醇和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。聚氧乙烯脱水山梨糖醇的脂肪酸酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯也是适用的非离子型表面活性剂。
阳离子表面活性剂优选是季铵盐，其中作为N-取代基含有至少一个C8-C22烷基，作为其他取代基含有卤代的或未取代的低级烷基、苄基或羟基低级烷基。这种盐优选是卤化物、甲基硫酸盐或乙基硫酸盐形式，例如硬脂基三甲基氮化铵或苄基二-(2-氯乙基)乙基溴化铵。
制剂领域中常用的表面活性剂在下列文献中有述，例如Ridgewood，N.J.的MC出版公司1979出版的“McCutcheon’表面活性剂和乳化剂手册”；Helmut Stache博士的“表面活性剂手册”Cart Hanser Verlag，慕尼黑/Vienna。
本发明杀虫剂组合物的另一特别优选的特征是施用于植物和土壤时的活性成分的持久性。引起活性损失的可能原因包括紫外线、热、叶的渗出液和pH的灭活作用。本发明杀虫组合物的制剂可以通过加入有助于防止活性成分损失的添加剂或将物料以保护活性成分不被灭活的方式进行包囊从而解决这些问题。可以用化学方法(McGuire和Shasha，经济昆虫学杂志851425-1433，1933)或生物方法(Bames和Cummings，1986；EP-A 019239)进行包囊。化学包囊法包括将活性成分用聚合物包衣，而生物包囊法包括杂合毒素基因在微生物中的表达。对于生物包囊，在制剂中使用含有杂合毒素蛋白的完整微生物作为活性成分。加入紫外防护剂可有效地降低辐射破坏。通过加入适当的添加剂可以控制由热导致的失活。
本发明有效的制剂包含营养细胞或更优选孢子形式(如果有的话)的微生物作为活性成分，例如适当的制剂可以由用多价阳离子交联并含有这些微生物的聚合物凝胶组成。这种方法例如在“植物病理学”75卷7期774-777页(D.R.Fravel等，1985)有述，其中用藻酸盐作为聚合物材料。从该出版物还已知载体材料可以同时使用。这种制剂一般是通过混合天然或合成的成胶聚合物如藻酸盐和多价金属离子的盐水溶液形成单一的小滴形式，微生物可能悬浮在两种反应溶液的一种或两种中。以液滴形式混合时开始形成凝胶、然后可能干燥这些凝胶颗粒。这种方法称为离子胶凝。根据干燥的程度，形成了紧密而坚固的聚合物颗粒，其结构通过多价阳离子交联并含有微生物，并且载体可控制地均匀分布在其中。颗粒大小可达到5mm。
在EP-A1-0097571中描述了一种基于部分交联多糖的组合物，其中除微生物外例如还可以含有研细的硅酸作为载体材料，例如通过二价钙离子进行交联。这种组合物的水活性不超过0.3。W.J.Cornick等在一篇综述中[生物防治方法的新趋势抑制农业害虫和疾病的替代方法，345-372页，Alan R.Liss公司，1990]描述了各种制剂系统，提到了用蛭石作为载体的颗粒和通过离子胶凝方法制备的藻酸盐密珠。D.R.Fravel在杀虫剂制剂和应用系统第11卷，ASTM STP 1112(美国测试和材料协会，费城，1992)173-179页中也描述了这种组合物，这可以用来配制本发明的重组微生物。
本发明杀虫组合物一般含有约0.1-99％，优选约0.1-95％，最优选约3-90％的活性成分，约1-99.9％，优选1-99％，最优选约5-95％的固体或液体佐剂，和约0-25％，优选0.1-25％，最优选0.1-20％的表面活性剂。
在优选实施方案中本发明杀虫组合物一般含有0.1-99％，优选0.1-95％的含至少一种重组形式新基因的重组微生物或其与其他活性成分的混合物，1-99.9％的固体或液体佐剂，和0-25％，优选0.1-20％的表面活性剂。
但商业产品一般配制成浓液形式，最终使用者一般使用浓度很低的稀制剂。该杀虫组合物还可以含有其他成分，例如稳定剂、防泡剂、粘度调节剂、粘合剂、增稠剂以及肥料或其他活性成分以获得特殊效果。
存在几种在稳定保持和表达基因的条件下将杂合毒素表达基因引入微生物宿主的方法。例如，可以构建这样的表达盒，其中目标DNA构建物与下列元件有效地连接为表达该DNA构建物的转录和翻译调节序列，与宿主序列同源的DNA序列以发生整合，和/或在宿主中起作用的复制系统，以产生整合和稳定保持。
转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始位点、操纵子、活化子、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。例如见美国专利5039523；美国专利4853331；EPO 0480762A2；Sambrook等，同上；分子克隆试验室手册，Maniatis等编，冷泉港试验室，纽约(1982)；高级微生物遗传学，Davis等编，冷泉港试验室，纽约(1980)；和其中引用的文献。
下列实施例用于说明本发明但无意于限制本发明。
试验实施例1单克隆抗体的产生1.1免疫
将适量的抗原(大约50微克玉米根叶甲BBMV)在非油基佐剂中乳化，用于免疫一组10只Balb/c小鼠，每两周加强免疫。第三次加强免疫注射7天后，从小鼠取血清样品，用如下所述的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定相对血清抗体滴度。滴度最高的一组4只小鼠进行最后为期3天的低剂量抗原加强免疫方案(约为常规免疫中所有剂量的十分之一)，用作下述融合试验的脾供体。
1.2融合选择4只比抗体滴度大于1∶5000的小鼠用于两个融合试验。无菌条件下取出脾，机械分散并按下述方法分离淋巴细胞。通过在0.017MTRIZMA碱中的0.155M氯化铵溶液(Sigma化学公司，St.Louis，MO)中保温，裂解红细胞。细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗两次，按下述密度梯度离心进一步纯化淋巴细胞。将细胞小心地置于比重为1.065的Ficoll溶液上(Sigma化学公司，St.Louis，MO；Van Mourik等，酶学方法，121174-182(1986))，450×g离心20分钟。含有密度大于1.065的细胞层中富集淋巴细胞，用于与骨髓馏细胞融合。
用分离的淋巴细胞和来自Balb/c的缺乏HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)的SP2/0浆细胞馏细胞系进行聚乙二醇介导的融合。淋巴细胞和骨髓馏细胞以4∶1的比例混合。彻底混合细胞混合物，离心并按下述方法融合(Oi等，Michell，B.B.和Shiigi，S.M.编的“细胞免疫学中选择的方法”一文(Freeman，San Francisco)351-371(1980)；Fazekas等，免疫学方法杂志，351-21(1980))。将细胞层小心地悬浮在1毫升50％聚乙二醇(PEG)中，不停地搅拌1分钟。用无血清RPMI培养基(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)稀释细胞，逐渐降低聚乙二醇的浓度。融合后，将融合细胞以80×g离心5分钟，重新悬浮并以每孔105-106的总细胞密度放置在96孔板上。加入通过用20微克/毫升丝裂霉素C处理非免疫脾细胞制得的脾饲养细胞，以向融合细胞提供补充生长因子。几天后用含有17.6微克/毫升氨基喋呤的HAT(次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶)培养基选择杂交瘤。最早在融合后3或4天，在倒置显微镜下筛选生长的菌落。但直到融合后10-14天才出现肉眼可见的菌落。在此阶段测定每孔上清液中的比抗体分泌量。
1.3筛选当检测在HAT选择中存活的杂交瘤菌落时，上清液用酶联免疫吸附试验筛选(Engvall，酶学方法，70419(1980)，Engvall等，免疫化学，8871(1971))。简单地讲，在每孔含有大约500纳克抗原的96孔微滴定板中培养杂交瘤细胞。如Engvall等在文献中描述的那样，适当的洗涤步骤后，用与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗鼠第二抗体鉴定结合的抗体。再经洗涤步骤后，用产色底物定量测定每孔中的酶活性。用自动ELISA读数器测定492nm处的吸光度(OD492)，以鉴定阳性菌落。对那些与玉米根叶甲BBMV强结合的杂交瘤细胞系再进行三次ELISA筛选，以排除那些也与哺乳动物或植物结合的单克隆抗体。更具体地讲，使用兔肠刷状缘膜和玉米叶微粒体膜制剂进行这些ELISA。还包括一次鉴定与欧洲玉米钻蛀虫BBMV有交叉活性的细胞系的ELISA。
按下述方法克隆那些其分泌的抗体与玉米根叶甲BBMV抗体结合但不与哺乳动物和植物蛋白结合的杂交瘤菌落。
1.4克隆在此阶段，将那些分泌具有显著抗原特异性之抗体的杂交瘤，在96孔板中以0.5、1和5个细胞/孔的靶浓度培养并克隆。提供生长因子(Sugasawara等，免疫学方法杂志，79276-275(1985))以促进杂交瘤细胞从限定的密度生长。2-3周后克隆足够大时，用“筛选”中描述的ELISA方法鉴定阳性克隆。然后扩增代表性的克隆以产生抗体。
1.5腹水生产将该杂交瘤作为姥鲛烷致敏的Balb/c小鼠(Brodeur等，免疫学方法杂志，71265-272(1984))中的腹水瘤生长，从而大量地产生适当的单克隆抗体。收集腹水，透析后的腹水通过蛋白A色谱部分纯化抗体。形成的抗体制剂分成等份冷冻。
能产生在本发明中有用的单克隆抗体的细胞系列于表1中。这些杂交瘤细胞系于1994年4月19日保藏在美国典型培养物保藏中心(美国，12301 Parldawn Drive，Rockville，MD20852)，ATCC保藏号示于表1中。
表1玉米根叶甲BBMV单克隆系
实施例2刷状缘膜小泡(BBMV)的分离2.1玉米根叶甲BBMV的分离基于Wolfersberger等描述的(化合物·生化·生理，86A301-308(1987))、English和Readdy(昆虫生物化学，19145-152(1989))改进的方法制备这些小泡。将第三龄幼虫的肠用Potter-Elvenhem匀浆器在冰冷的50mM蔗糖、2mM Tris-Cl(pH7.4)、0.1mM苯基甲磺酰氟中匀浆化。加入氯化铯至10mM，在冰上搅拌匀浆物15分钟。4℃下4300×g离心10分钟，弃去沉淀。上清液以27000×g离心10分钟，将沉淀重新悬浮在0.32M的蔗糖中。将此悬浮液通过一27号针，于-70℃下保存。
2.2欧洲玉米钻蛀虫BBMV的分离从第5龄欧洲玉米钻蛀虫(ECB)切出肠，纵向切开除去其中的食物和围食膜。用上述方法分离ECB的BBMV。
2.3植物微粒体的分离玉米植物(黑暗中，28℃生长72小时)的叶或根组织，用研钵和杵在等体积的0.3M磷酸钾pH7.4，5mM DTT和1％(重量/体积)PVPP中研磨。将混合物用四层薄棉布过滤，然后以10000×g离心15分钟。上清液再以100000×g离心60分钟，将沉淀重新悬浮在0.1M磷酸钾pH7.4中。
2.4哺乳动物肠BBMV的分离用与分离昆虫肠刷状缘膜小泡相似的方法，从兔十二指肠和基质(Kessler等，BBA 506136-154(1978))的粘膜表面制备哺乳动物的刷状缘膜。洗涤新鲜的兔十二指肠和下胃的粘膜衬，从基质下分离粘膜层。将该材料悬浮在十倍体积的冰冷的50mM蔗糖，0.1mM PMSF，2mM Tris-HCl(pH7.4)中，用15冲程(stroke)匀化器在冰上匀化。加入氯化钙至终浓度为10mM，在冰上搅拌混合物15分钟，4℃下以4300×g离心匀浆10分钟。收集上清液再以27000×g离心10分钟。将沉淀重新悬浮在0.32mmol蔗糖中，-70℃冷冻。
实施例3玉米根叶甲BBMV单克隆细胞系的鉴定将ELISA中与玉米根叶甲BBMV强结合的单克隆细胞系进行进一步筛选，以选择不与玉米微粒体也不与哺乳动物微粒体交叉反应的克隆。用玉米叶和根微粒体和兔肠膜小泡进行进一步的ELISA。所有的细胞系同时对欧洲玉米钻蛀虫BBMV蛋白进行筛选。从筛选的78个细胞系中分离到了对玉米根叶甲特异的11个系。除此之外还分离到与欧洲玉米钻蛀虫BBMV交叉反应的4个系。这15个细胞系代表分泌IgG1、Ig2a、IgG2b、IgG3和IgM的单克隆细胞系。通过western印迹分析这些单克隆细胞系以证实其玉米根叶甲特异性和对兔微粒体或玉米微粒体的无交叉反应性。还鉴定了抗体与各种玉米根叶甲BBMV蛋白的特异结合，示于

图1中。发现了5中不同的结合方式两种是对一种或两种蛋白特异的，其他三种代表与7-15种蛋白的结合。与7-15种蛋白结合的这一组基于其结合方式进一步分为A、B、C三小类。
3.1单克隆细胞系的western分析按如上所述制备刷状缘膜小泡并在8-16％丙烯酰胺SDS蛋白凝胶(Novex，San Diego，CA)上进行电泳。将蛋白转印到硝基纤维素膜上(Burnette，W.N.，Western印迹，112195(1981))，然后与杂交瘤细胞系的上清液结合。抗体与印迹蛋白的结合用标准方法显影(例如见，抗体实验室手册，E.Harlow和D.Lane，冷泉港，1988，和其中所引的文献)。
实施例4玉米根叶甲结合性抗体域的克隆获取玉米根叶甲特异性抗体基因的各种方法是已知的。一种方法是在噬菌体中克隆一个抗体基因的随机文库并针对与玉米根叶甲肠蛋白的结合能力筛选该文库。另一已知方法是制备与玉米根叶甲肠蛋白结合的单克隆抗体，然后从这种抗体系克隆抗体基因。本实施例中使用第二种方法。利用恒定区中的保守DNA序列和可变区的支架区作为引物并用聚合酶链反应扩增，可以从杂交瘤细胞克隆得到抗体基因。这种方法的一般性描述见Mullis等，酶学方法，155335-350(1987)；Erlich(编)，PCR技术，Stockton出版社(纽约1989)。已成功地利用了Kabat等收集的小鼠重链和轻链序列数据库来产生用于抗体基因克隆的同型特异性引物和降解引物(Kabat，E.A.等，1987，美国Dept Health and Human Services，美国政府出版局，和Jhons等，1991，生物技术988-89)。另外，克隆较小的具有原始抗体结合特性的抗体片段(Fab)的技术是熟知的。全抗体是大分子(150kDa)，但是小得多的Fab和Fv抗原结合片段(12kDa-50kDa)已显示保留了全部结合亲和力。其中Vh和VI区由一亲水柔性肽连接的单链Fv片段已成功地用于靶酶，并对特异细胞有毒性(Bird(1988)科学423423-426和Huston(1988)PNAS 855879-5883)。小至20个氨基酸称为最小识别单位(mru)的单链Vh区(Dab)和单链互补决定区也用于抗原结合(Ward(1989)自然341544-546和Taub(1989)，生物化学杂志.264259-265和Willams(1989)PNAS 865537-5541)。因此，可以将玉米根叶甲特异结合区减小到很小的片段。
4.1通过PCR克隆抗体基因使用聚合酶链反应技术和特异寡核苷酸引物克隆免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的某个区。从上述Kabat数据库选择了对IgM和三种IgG同型的重链和轻链特异的PCR引物。设计成熟可变区氨基末端编码区的引物使其从第一支架区起始，并在制备中使用一些密码子简并，使它们可用作“通用引物”。用于可变区特异PCR扩增的3’’引物是从重链和轻链的第一恒定域(CH1)的保守序列设计得来的。对免疫球蛋白同型IgG1(3B1和17F6)、IgG3(10B6)和IgM(2B5)使用一种不同的3’引物。可以用IgG1所用的相同引物扩增同型IgG2A和IgG2B。将抗体可变区克隆到含有内质网信号肽和分别含IgG1轻链和重链的轻链(pCIB4612)和重链(pCIB4611)表达载体中。
表2显示用于PCR克隆小鼠免疫球蛋白轻链和重链可变区的引物结构。或者，可以使用的引物序列可以在出版的文献中找到(Coloma等，生物技术，11152-156，1991；Jones等，生物技术，988-89，1991)。用下述标准条件在应用生物系统DNA合成仪380B(应用生物系统，福斯特城，CA)合成寡核苷酸。这些PCR引物含有限制性位点，在扩增和消化后克隆到CaMV 35S启动子控制下的一种植物表达载体中。选择的限制性位点是已知在已测序的抗体基因中不存在的。
表2用于抗体基因扩增的PCR引物pCIB4614，pCIB4616，pCIB4625，pCIB4636和pCIB4617中的3B1，2B5，10B6，14G1和17F6轻链可变区NC925’引物5＇-GTC TCG AGG AYA TYS WGM TSA CCC ART CT-3’(SEQ ID NO37)NC1303’引物5＇-GCA GAT CTA GTT GGT GCA GCA TCA GCC CG-3’(SEQ ID NO38)pCIB4613和pCIB4609中的3B1和17F6重链可变区NC915’引物5＇-GTC TCG AGC AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG-3’(SEQ ID NO39)NC1143’引物5＇-GCA GAT CTA GAT CCA GGG GCC AGT GGA TA-3’(SEQ ID NO40)pCIB4615中的2B5重链可变区NC915’引物5＇-GTC TCG AGC AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG-3’(SEQ ID NO39)NC1113’引物5＇-GCA GAT CTG CAG GAG ACG AGG GGG AAG ACA TT-3’(SEQ ID NO41)pCIB4637中的10B6重链可变区DB915’引物5＇-ACG TCT CGA GGA RGT GAA GCT KRW KGA RWC TG-3’(SEQ ID NO48)NC1173’引物5＇-GCA GAT CTG CAG CCA GGG ACC AAG GGA TA-3’(SEQ ID NO42)pCIB4635中的14G1重链可变区DB915’引物5＇-ACG TCT CGA GGA RGT GAA GCT KRW KGA RWC TG-3’(SEQ ID NO48)DB1143’引物5＇4CAA TTC GCA TAT GAG ATC CAG GGG CCA GTG GAT A-3’(SEQ ID NO49)Y＝C或T；S＝C或G；W＝A或T；M＝C或A；R＝A或G从杂交瘤细胞系分离的Poly-A+RNA用于产生cDNA第一链以用于以后的PCR反应。利用快速微量mRNA分离试剂盒(Invitrogen公司，SanDiego，CA)，基于硫氰酸胍裂解和oligo(dT)纤维素纯化的方法，从108个杂交瘤细胞中提取Poly-A+RNA。从108个细胞中提取的RNA中约十分之一用于产生cDNA第一链。将RNA与脱氧核苷酸(每种dNTP 0.2mM)、5微克作为引物的随机六聚物pd(N6)(Pharmacia LKB生物技术公司，Piscataway，NJ)、50单位莫落尼氏白血病毒逆转录酶(Pharmacia LKB生物技术公司，Piscataway，NJ)和1×PCR缓冲液的混合物在42℃保温30分钟，然后于95℃加热5分钟，反应体积为100微升。该cDNA第一链反应液用苯酚-氯仿提取，并通过大小排阻旋转柱(Chroma Spin30，Clontech实验室，Palo Alto，CA)以除去随机六聚物。然后，按照Perkin-Elmer Cetus扩增试剂盒的说明，向含有免疫球蛋白特异性引物的50微升PCR反应混合物中加入十分之一(或10微升)的cDNA第一链反应液。用Perkin-ElmerCetus Thermal Cycler扩增该混合物20个循环。PCR所有的温度和时间如下94℃变性1分钟；52℃退火1.5分钟；72℃延伸1分钟。PCR产物在6％丙烯酰胺凝胶(Novex，Encinitas，CA)上电泳，从凝胶条上纯化DNA。将凝胶条在200微升TE中研细，通过Ultrafree-MC Millipore柱(Millipore，Bedford，MA)离心而纯化。洗脱液用50微克/毫升蛋白酶K在37℃处理30分钟，用苯酚-氯仿-异戊醇(50∶48∶2)提取，然后用氯仿提取并用乙醇沉淀。将DNA悬浮在40微升TE中，用适当的限制酶消化。抗体可变区的PCR产物用XhoI和Bgl II消化，按上述方法再用6％丙烯酰胺凝胶纯化。最后将Xho I/BglII片段连接到用Xho I和Bgl II消化的轻链表达载体(pCIB4612)或重链表达载体(pCIB4611)中。表达载体pCIB4612含有CaMV 35S启动子和终止序列，及19个氨基酸信号肽序列和轻链恒定区CH1。轻链可变区克隆在Xho I/Bgl II位点以表达全长的轻链。
所有抗体基因除10B6的重链和14G1的重链和轻链外都按上述方法克隆。后几种抗体基因从PCR产物克隆，但产物在6％丙烯酰胺TBE凝胶上分离，从凝胶上切下的片段用0.7M LiCl+2mM EDTA洗脱，沉淀并重新悬浮在10mM Tris+2mM EDTA(pH7.5)中。分离的PCR产物直接连接到来自pUC的克隆质粒pT&Blue T(Novagen公司)中。因为Taq DNA聚合酶使反应产物具有单链3’A-核苷酸粘端(Clark，核酸研究，169677(1988))，这些产物可以直接克隆到含有相容性单链T-核苷酸粘端的载体中(Marchuk等，核酸研究，191154(1990))。
pCIB4612载体是将来自小鼠IgK链的155个碱基对的Dde I/Sty I轻链恒定区(Schulze-Gahmen等，1988，生物化学杂志，26317100-17106；Katat等，美国健康和人体事物部，美国政府出版局(1987))以四种方式与71bp的Xho I/Dde I片段、101bp的Sty I/Bgl II片段和来自pCIB4610的3.8Kb的Xho I/Bgl II载体片段连接制得的。寡核苷酸KE109A28和KE110A28杂交以制备具有Sty I和Bam HI交错切割末端的101bp片段。KE109A285＇-CAA GGA CGA GTA TGA ACG ACA TAA CAG CTA TAC CTGTGA GGC CAC TCA CAA GAC ATC AAC TTC ACC CAT TGT CAA GAG CTTCAA CAG GAA TGA GTG TTA GG- 3＇(SEQ ID NO19)KE110A285＇-GAT CCC TAA CAC TCA TTC CTG TTG AAG CTC TTG ACAATG GGT GAA GTT GAT GTC TTG TGA GTG GCC TCA CAG GTA TAG CTGTTA TGT CGT TCA TAC TCG TC- 3＇(SEQ ID NO20)寡核苷酸KE111A28和KE112A28杂交以制备具有Xho I和Dde I交错切割末端的71bp片段。KE111A285＇-TCG AGG GTA CCG AGC TCT AGA TCT GTA TCC ATC TTCCCA CCA TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC-3＇(SEQ IDNO21)KE112A285＇-TGA GGC ACC TCC AGA TGT TAA CTG CTC ACT GGA TGGTGG GAA GAT GGA TAC AGA TCT AGA GCT CGG TAC CC-3＇(SEQ IDNO22)载体pCIB4611含有重链恒定区CH1-CH3，同样可以将重链可变区克隆到Xho I/Bgl II位点，以表达全长的重链。pCIB4611是这样制备的将来自小鼠IgGG1γ链的Nco I/Bst XI902bp重链恒定区(Honjo等，1979，自然，277627-633；Katat等，美国健康和人体事物部，美国政府出版局(1987))与两个40bp的杂交寡核苷酸片段连接，将最后的982bp片段连接到用Bgl II和Xho I消化的pCIB4610中。其中一个40bp片段从寡核苷酸KE106A28和KE107A28杂交得到并具有Xho I/Nco I交错切割末端，另一个40bp片段从寡核苷酸KE108A28和KE105A28杂交得到并具有BstXI/Bam HI交错切割末端。KE106A285＇-TCG AGG GTA CCG AGC TCT AGA TCT GCT GCC CAA ACTAAC TO-3＇(SEQ ID NO23)KE107A2285＇-CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AGA TCT AGA GCT CGGTAC CC-3＇(SEQ ID NO24)KE108A285＇-CTG GTA AAG GCG GCC GCA TCG ATT AAG TCG ACC CGCGGG- 3＇(SEQ ID NO25)KE105A285＇-GAT CCC CGC GGG TCG ACT TAA TCG ATG CGG CCG CCTTTA CCA GGA GA- 3＇(SEQ ID NO26)pCIB4610载体在CaMV 35S启动子和CaMV 35S终止子序列之间含有19氨基酸小鼠内质网信号肽序列。pCIB4610载体通过Bam HI和HpaI消化的pCIB4600与83bp的PCR产生的Bam FI和Hpa I消化片段连接而制成。该PCR片段是用pCIB4600作为模板用引物KE102A28和KE101A28制得的。pCIB4610和pCIB4600的区别仅在于CaMV 35S启动子后的非翻译引导区。pCIB4610含有植物的保守翻译起始序列AACAATG(SEQ ID NO27)，其中ATG是翻译起始处，pCIB4600含有序列TCCG ATG(SEQ ID NO28)。
KE102A285＇-CGA AGT TAA CAG ATC TAG AGC TCG G-3＇(SEQ ID NO29)KE101A285＇-CGG GAT CCA ACA ATG GGA TGG AGC TGG ATC TT-3＇(SEQ ID NO30)通过用Bam HI和Sac I消化的CaMV 35S表达载体pCIB710(Rothstein等，1987，基因，53153-161)衍生物与编码内质网信号肽的86bp Bam HI/Sac I(Katat等，美国健康和人体事物部，美国政府出版局(1987))片段连接制备载体pCIB4600。该86bp片段含有下列序列5＇-GAT CCA ACA ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCAGTT GTT ACC CTA CCT CGA CCT AGA AAG AGA AGG AGG ACA GTG GAGCTG CAG GTG TCC ATT GCC TAC TCG AGG GTA CCG AGC TCC TCG ACGTCC ACA GGT AAC GGA TGA GCT CCG ATG GC- 3＇(SEQ ID NO31)从玉米根叶甲单克隆抗体系将重链和轻链可变区克隆到表达载体中产生下列构建物pCIB46133B1重链可变区pCIB46143B1轻链可变区pCIB46152B5重链可变区(NRRL B-21216)pCIB46162B5轻链可变区(NRRL B-21217)pCIB460917F6重链可变区(NRRL B-21215)pCIB461717F6轻链可变区(NRRL B-21218)pCIB463710B6重链可变区(NRRL B-21279)pCIB462510B6轻链可变区(NRRL B-21219)pCIB463514G1重链可变区(NRRL B-21277)pCIB463614G1轻链可变区(NRRL B-21278)pCIB46313B1轻链和重链可变区(NRRL B-21220)后面注有NRRL号的上述表达载体已于1994年3月7日保藏在“北方地区研究中心”的农业研究部专利培养物保藏中心(NRRL)(美国伊利诺州，61604，Peoria，北方大学街1815)，其中pCIB4637、pCIB4635和pCIB4636是在1994年6月3日保藏的。
表3列出了可变区序列的序列号。pCIB4613、pCIB4617、pCIB4625、pCIB4637、pCIB4635和pCIB4636的序列是完整的可变区，从可变区的第一支架区的第一个密码子开始以第四支架区的最后一个密码子结束。pCIB4609是不完整的，编码序列的5’末端被截去，从可变区的第二个CDR区开始。
表3
抗体链DNA序列SEQ ID NO13B1重链可变区DNASEQ ID NO23B1重链可变区蛋白SEQ ID NO33B1轻链可变区DNASEQ ID NO43B1轻链可变区蛋白SEQ ID NO52B5重链可变区DNASEQ ID NO62B5重链可变区蛋白SEQ ID NO72B5轻链可变区DNASEQ ID NO82B5轻链可变区蛋白SEQ ID NO917F6重链可变区DNASEQ ID NO10 17F6重链可变区蛋白SEQ ID NO11 17F6轻链可变区DNASEQ ID NO12 17F6轻链可变区蛋白SEQ ID NO13 10B6重链可变区DNASEQ ID NO14 10B6重链可变区蛋白SEQ ID NO15 10B6轻链可变区DNASEQ ID NO16 10B6轻链可变区蛋白SEQ ID NO17 3B1轻链可变区DNASEQ ID NO18 3B1轻链可变区蛋白SEQ ID NO44 14G1重链可变区DNASEQ ID NO45 14G1重链可变区蛋白SEQ ID NO46 14G1轻链可变区DNASEQ ID NO47 14G1轻链可变区蛋白4.2 DNA寡聚物的合成利用应用生物系统380B型DNA合成仪和标准的操作步骤合成DNA寡聚物。在一0.2μmol宽孔小量ABI柱进行新式的SSCAF3循环。最后的步骤是去除三苯甲基并用380B自动裂解循环将寡聚物从柱上解下。然后寡聚物在过量氢氧化铵中55℃解封8-12小时。然后在一蒸发器中用氮气干燥，再将寡聚物重新悬浮在0.25-0.5ml去离子水中。
4.3合成DNA寡聚物的纯化将每种寡聚物的等份与等体积蓝染料/甲酰胺混合物混合，终溶液中含有0.05％的溴酚蓝、0.05％的二甲苯苯胺FF和25％的甲酰胺。将混合物在95℃加热10分钟使寡聚物退火。上样于含7M脲的12％聚丙烯酰胺-脲(Sambrook等)上。用Vertical Slab Gel Unit(Hoefer科学仪器，旧金山，CA)在300-400伏电泳3-4小时后，用紫外显示仪确定凝胶上正确大小片段的位置，然后用剃须刀片切下。将纯化的凝胶片段切碎并在0.4MLiCl，1mM EDTA(pH8)缓冲液中37℃保温过夜。
使用下列两种方法中的任何一种从聚丙烯酰胺凝胶残留物中分离寡聚物Gel/X(Genex公司，Gaitherburg)微孔聚乙烯过滤单元或Milliporeultrafree-MC0.45微米过滤单元。纯化的寡聚物用乙醇沉淀，在微量离心管中4℃离心20分钟回收，最后重新悬浮在TE(10mM Tris，1mMEDTA，pH8.0)中。按照260nm处的吸光度读数，调节粘端至50纳克/微升。
4.4激酶处理寡聚物每20微升激酶反应液中使用1pmol的纯化寡聚物，缓冲液中含有7.0mM Tris pH7.5，10mM KCl，1mM MgCl2，0.5mM DTT，50μg/ml BSA，3000μCi(3pmol)32P-γ-ATP和8单位的T4聚核苷酸激酶。激酶反应液在37℃保温1小时，然后用苯酚/氯仿提取，用糖原作为载体进行三次乙醇沉淀(Tracy，制备和生物化学，11251-268(1981))。
4.5杂交寡聚物用于直接克隆将要进行杂交的寡聚物合并在一起(总DNA1-20微克)，在含有30mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT和1mM dATP的1×Promega连接缓冲液中37℃下激酶处理1小时。根据总DNA的量，在该反应混合物中使用1-20单位的T4聚核苷酸激酶。将该反应置于开水浴上5分钟终止该激酶化反应。合并寡聚物与杂交缓冲液的体积是50-100微升，调节最终盐浓度为100mM NaCl，120mM Tris pH7.5和10mMMgCl2。合并激酶化和未激酶化的寡聚物，在开水浴中加热5分钟，在约4小时内慢慢冷却到室温。杂交的寡聚物用苯酚/氯仿提取，乙醇沉淀，并重新悬浮在17微升的TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)中。用它组成终体积20微升的连接反应液(30mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mMDTT、1mM ATP和3单位T4 DNA连接酶(Promega，Madison，WI))。该连接反应液在室温保持约2小时。在用限制性内切酶酶切前和/或后和克隆到载体之前，杂交/连接片段一般在2％Nusieve琼脂糖(FMC生物产品公司，Roclland，ME)凝胶纯化。用100纳克-500纳克的每种片段和约等摩尔量的DNA在30mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mMATP和3单位T4 DNA连接酶(Promega，Madison，WI)中组成20微升连接反应液。该连接反应液在室温下保持2小时。连接后，用标准方法(Sambrook等)将DNA转化到冷冻的感受态大肠杆菌细胞中，在含100微克/毫升氨苄青霉素的LB-琼脂(Sambrook等)上挑选转化子(见下文)。
实施例5单链抗体(SCA)分子的构建pCIB4631含有对玉米根叶甲BBMV特异的与抗体重链恒定区融合的单链抗体(SCA)的基因。该SCA基因包含抗体3B1轻链和重链可变区片段(来自对玉米根叶甲BBMV特异的单克隆抗体系3B1)与19氨基酸内质网信号序列的融合。在轻链和重链Fv片段之间是10个氨基酸(GGGGSGGGGS；SEQ ID NO32)的接头区(Huston等，PNAS 855879-5883(1988))。连接4.1Kb Xba I/Xho I片段(Fv重链恒定区CaMV 35S终止区来自pCIB4613的载体片段)、1.4Kb Xba I/Bgl II片段(CaMV 35S启动子来自pCIB4614的轻链Fv片段)和具有Bgl II/Xho I交错切割的限制酶位点末端的杂交的36碱基对接头片段，制得pCIB4631。
寡核苷酸KE147A28和KE182A28一起杂交以制备36碱基对的接头KE147A285′-GAT CTG GTG GCG GTG GCT CGG GCG GTG GTG GGTCGC-3′(SEQ ID NO33)KE182A285＇-TCG AGC GAC CCA CCA CCG CCC GAG CCA CCG CCA CCA-3′(SEQ ID NO34)如上所述在12％聚丙烯酰胺/7M脲凝胶上纯化寡聚物，按标准方法利用紫外显示仪切下正确大小的寡聚物。如上所述将寡聚物激酶化和杂交。
表达载体pCIB4631已于1994年3月7日保藏在“北方地区研究中心”的农业研究部专利培养物保藏中心(NRRL)(美国伊利诺州，61604，Peoria，北方大学街1815)，保藏号为NRRL B-21220。
实施例6单链抗体结合特性的鉴定单链抗体蛋白在分离的玉米原生质体中表达，并在Western印迹中和免疫截面实验中的玉米根叶甲中肠横截面上显示与玉米根叶甲BBMV蛋白结合(Bravo等，1992，病理调查杂志，60237-246，Bravo等，1992，病理调查杂志，60247-253)。
6.1玉米悬浮细胞原生质体的分离将来自“汽巴种子”玉米近交系(B72型)或黑墨西哥甜菜未成熟胚培养物的胚发生悬浮培养物在27℃130rpm摇床上保持在补有3％蔗糖和2毫克/升2，4-D的N6基础培养基中(Chu等，1975)，每周分培。分培1-2天后收集悬浮细胞并重新悬浮在酶溶液中(3％纤维素酶RS+1％macerozymeR10溶于KMC8.7g/l KCl，12.5g/lCaCl2，16.4g/l MgSO4，5g/lMES，pH5.7)，每20毫升酶溶液加2毫升体积的压紧细胞。将细胞分装在100×25mm的培养皿中，在室温50rpm的摇床上培养4小时。
6.2原生质体的转化分离原生质体分离后立即以6百万/毫升的密度重新悬浮在RS缓冲液中(0.45M甘露醇，15mM CaCl2，0.1％MES，pH5.7)。向17×100mm的聚苯乙烯管中加入0.5毫升，然后加入50微克pCIB4631 DNA和50微克CaMV 35S GUS作为转化对照，例如来自克隆技术实验室(Palo Alto，CA)的pB1221。向每管中加入0.5毫升PEG溶液(40％PEG6000，0.4M甘露醇，0.1M Ca(NO3)2)，轻轻地摇动与原生质体混合。室温培养30分装后，用1毫升、2毫升、5毫升和10毫升W5(9.0g/l NaCl，18.5g/l CaCl2，0.37g/lKCl，0.9g/l葡萄糖，pH5.6)以5分钟的间隔逐步稀释原生质体，沉降，重悬于铺板培养基中(MS盐，B5维生素，3％蔗糖，2mg/l 2，4，-D，0.3M甘露醇)，密度为2×106原生质体/毫升。黑暗中26℃培养原生质体。18-22小时后将原生质体收集在Eppendorf管中，沉降，并重悬于0.4毫升提取缓冲液中(100mM KHPO4pH7.8，1mM DTT)。然后超声处理样品10秒钟，离心沉降碎片。
6.3单链抗体与玉米根叶甲BBMV的结合如上所述制备刷状缘膜小泡并在8-16％丙烯酰胺SDS蛋白凝胶上(Novex，San Diego，CA)电泳。将蛋白转移到硝基纤维素膜上(Burnette，W.N.，Western印迹，112195(1981))，并让其与含有单链抗体蛋白的玉米原生质体提取物结合。在Western印迹上，由pCIB4631表达的玉米根叶甲BBMV特异性3B1单链抗体蛋白与原始3B1单克隆抗体结合相同分子量的BBMV蛋白。在免疫截面试验中，玉米原生质体表达的单链抗体也与玉米根叶甲中肠的横截面结合(Bravo等，1992，病理调查杂志，60237-246，Bravo等，1992，病理调查杂志，60247-253)。
实施例7玉米根叶甲特异性免疫毒素的构建将玉米根叶甲特异性单链抗体与假单胞菌内毒素A的毒性区融合。假单胞菌内毒素A已用于合成治疗癌症和免疫疾病的重组杂合抗体-毒素融合蛋白(Pastan，I和FitzGerald，D.，1989，生物化学杂志，26415157-15160，和Pastan，I等，生物化学年度综述，1992，61331-54)。假单胞菌内毒素的结构已被完全鉴定，其作用方式是已知的。抗体杂合毒素作为杀虫剂的概念是新颖的，此类途径没有先例。
假单胞菌内毒素(PE)是由假单胞菌P.aeruginosa分泌的单链毒素。它通过催化不可逆的ADP-核糖基化和灭活翻译延长因子2(EF-2)来杀死细胞。PE的结构已完全鉴定(Chaudhary，V.K.，1990，生物化学杂志，26516303-16310)，它由三个结构域组成。结构域Ia负责细胞识别和PE与靶细胞的结合，ADP-核糖基化活性转移到胞液中需要结构域II，结构域III是ADP-核糖基化活性。当毒素进入细胞时被内吞小泡内在化，此时发生裂解产生37KD的结构域III“活化毒素”。结构域Ia缺少就去除了细胞结合区，产生了细胞毒性“极低”的40kD蛋白(PE40)。抗体与PE40融合已用于制备许多治疗癌症的重组免疫毒素。相信抗体-PE40融合物结合后必然通过受体介导的细胞内吞作用内在化，以适当地活化PE40和随后进入胞液的通道。
将玉米根叶甲3B1单链抗体的重链羧基末端与PE毒性区融合，因为已证明PE40氨基末端的融合能保持细胞毒性。也可能设计这样的融合物，其中单链抗体与PE40的氨基末端融合(Prior等，细胞，64卷1017-1023)。在大肠杆菌表达载体中制备和检测单链抗体融合物，使用p-FLAG表达载体，其中含有IPTG可诱导的tac启动子和随后的编码ompA信号肽(引导向外周胞质分泌的信号肽)的序列和编码8氨基酸FLAG表位序列，所述表位有利于通过抗体亲和色谱分离重组蛋白。从p-FLAG表达载体中纯化单链抗体融合蛋白。将纯化的SCA融合蛋白搀入玉米根叶甲的食物中进行活性测定。
通过将包括PE40和含有3B1单链抗体的790bp Hind III/Sph I片段的约1.2Kb Sph I/Eco RI片段连接到Hind III/Eco RI消化的5.37Kb pFLAG载体(IBI，New Haven，CT)上，来制备与PE40融合的单链抗体。PE40片段来自pWW20，后者是一种在pUC9载体(Wels等，1992，癌症研究526310-6317)中含有在可诱导Lac启动子控制下的假单胞菌内毒素毒性结构域的载体。通过用pCIB4631作为模板用寡聚物NC200和NC202为引物进行PCR产生含有3B1单链抗体的700bp片段。
NC2005′-CGA AGC TTG ACA TTG TGC TGA CCC AG-3′(SEQ ID NO35)NC2025′-GCC CTC TAG AAG CAT GCC TGA GGA GAC GGT GAC TGA-3′(SEQ ID NO36)实施例8植物中的转化和表达按常用的方法将由抗体区与毒素区融合组成的杂合毒素转化到植物中，如WO 93/07278，08/008006和08/037057中所述。由两个独立的抗体链或抗体区与毒素融合组成的二元毒素用一般细胞加工方法在植物中表达和组装。可以在植物胞质中表达单链抗体-毒素蛋白以作用于植物的非原质体，或者杂合毒素具有细胞毒性时在植物细胞中表达以作用于细胞器(Taviadorali等，1993，自然，366469-472；Owen等，1992，生物技术，10790-794；Firek等，1993，植物分子生物学，23861-870)。使用文献中已知的技术通过内质网将蛋白定向于叶绿体或液泡。在文献中描述了羧基端前肽形式的液泡靶向信号(Bednarek S.等，1991，植物细胞，31195-1206；Neuhaus J-M等，1991，PNAS8810362-10366；Bednarek S.等，1992，植物分子生物学，20133-150；Chrispeels M.J.等，1992，细胞，68613-616；Nakamura K等，1993，植物生理学，1011-5；Dombrowski J.E.等，1993，植物细胞，5587-596；Schroeder M.R.等，1993，植物生理学，101451-458)。文献中描述了N-末端转移肽形式的叶绿体靶向信号(VanDen Broeck G.等，1985，自然313358-363；Smeekens S.等1987，植物分子生物学，9377-388；Szabo L.J.等，1987，在T.Hohn和J.Schell编的植物DNA感染剂(纽约，Springer Verlag，Wein)中321-339页；Keegstra K.等，植物生理植物分子生物学年度综述，40471-501)。
本发明提供构建靶向特异昆虫的毒素分子的材料和方法。特别是靶向那些能逃脱毒素结合和Bt内毒素的细胞毒作用的昆虫。另外，构建了对具体害虫有特异性的毒素分子。本说明书中提到的所有出版物和专利申请说明与本发明有关的领域中技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请引入本文作为参考，其引用程度如同每篇特异地单独地引入。虽然前文为清楚理解的目的以说明和实施例的方式比较详细地描述了本发明，但很显然可以在权利要求范围内进行某些改变和修改。
实施例9制剂实例下列制剂实例中使用的活性成分是按实施例7制备的纯化SCA融合蛋白。
A1.可湿性粉末
a) b) c)活性成分 25％50％ 75％木素磺酸钠 5％ 5％-月桂基硫酸钠3％ - 5％二异丁基萘磺酸钠- 6％ 10％辛基苯酚聚乙二醇醚 - 2％-(7-8摩尔的环氧乙烷)高分散的硅酸5％10％ 10％高岭土 62％27％-将孢子与佐剂彻底混合，将混合物在适当的磨中彻底研磨形成可湿性粉末，它可以用水稀释得到理想浓度的悬浮液。
A2.可乳化浓液活性成分10％辛基苯酚聚乙二醇醚(4-5摩尔的环氧乙烷)3％十二烷基苯磺酸钙 3％蓖麻油聚乙二醇醚(36摩尔的环氧乙烷) 4％环己酮 30％二甲苯混合物50％用水稀释可以从该浓液得到任何所需浓度的乳液。
A3.粉尘剂a) b)活性成分 5％ 8％滑石 95％ -高岭土 - 92％
将活性成分与载体混合并在适当的磨中研磨得到即用的粉尘剂。
A4.挤出颗粒活性成分10％木素磺酸钠 2％羧甲基纤维素 1％高岭土 87％将活性成分或其组合与佐剂混合，然后混合物用水润温。将混合物挤出、制粒并在空气流中干燥。
A5.包衣颗粒活性成分 3％聚乙二醇(分子量200)3％高岭土94％在一混合机中将活性成分或其组合均匀地施于用聚乙二醇润湿的高岭土上。这样得到了非粉尘的包衣颗粒。
A6.悬浮浓液活性成分 40％乙二醇 10％辛基苯酚聚乙二醇醚(15摩尔的环氧乙烷)6％木素磺酸钠 10％羧甲基纤维素1％37％甲醛水溶液0.2％75％水溶液形式的硅氧烷油 0.8％水 32％
活性成分与佐剂紧密混合得到悬浮浓液，用水稀释可从中制得任何所需浓度的悬浮液。
附图的简要说明图1丙烯酰胺凝胶电泳后，单克隆抗体与玉米刷状缘膜小泡结合的Western印迹分析。在此分析中使用了来自细胞系3B1、2B5、17F6和10B6的抗体。MW＝分子量标准。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称CIBA-GEIGY AG(B)街道Klybeckstr.141(C)城市Basel(E)国家瑞士(F)邮政编码4002(G)电话+4161691111(H)传真+41616967976(I)电传962991(ii)发明名称与昆虫肠蛋白结合的抗体和其应用(iii)序列数49(iv)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度357碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS
(B)位置1..357(D)其他信息/注＝“来自pCIB4613的3B1重链可变区”(xi)序列描述SEQ ID NO1CAG GTC AAA CTG CAG GAG TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG 48Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly1 5 10 15TCA TTG AAA CTC TCA TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAC TTC 96Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe20 25 30GCC ATG AAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT 144Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45GCT CGC ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA TCT TAT GGC GAT 192Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp50 55 60TCA GTG AAA GAC AGG TTC ACC GTC TCCAGA GAT GAT TCA CAA AGC ATG 240Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met65 70 75 80TTC TAT CTG CAA ATG AAC AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT 288Phe Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr85 90 95TAC TGT GTG AGG GTA GTA TAC GGT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA 336Tyr Cys Val Arg Val Val Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 357Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度119氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe20 25 30Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp50 55 60Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met65 70 75 80Phe Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr85 90 95Tyr Cys Val Arg Val Val Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度333碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..333(D)其他信息/注＝“来自pCIB4614的3B1轻链可变区(#21 Fv Ab)”(xi)序列描述SEQ ID NO3GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG 48Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT CAT TAT 96Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr20 25 30GAC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAC CAA GGA TCC GGG GTC CCT GCC 192Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala50 55 60AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT 240Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His65 70 75 80CCT ATG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATA TAT TTC TGT CAG CAA AGT AGG 288Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg85 90 95GAA CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC ACG CTG GAA ATA AAA 333Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys100 105 110(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度111氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr20 25 30Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Set Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg85 90 95Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys100 105 110(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度372碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..372(D)其他信息/注＝“来自pCIB4615的2B5重链可变区”(xi)序列描述SEQ ID NO5CAG GTG CAA CTG CAG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT 48Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15TCT CTG AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30TAT ATG ACC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCA CIT GAG TGG TTG 144Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45GGT TTT ATT AGA CAC AAA GCT AAT GGT TAC ACA ACA GAA TAC AGT GCA 192Gly Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala50 55 60TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT AAT TCC CAA AAC ATC 240Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Ile65 70 75 80CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GCT GAG GAC AGT GCC ACT TAT 288Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr85 90 95TAC TGT GCA AGA GAT ATA TGC TAT GGT TAC GAC GTT GGG GCT CTG GAC 336Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Cys Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Ala Leu Asp100 105 110TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 372Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度124氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO6Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Ile65 70 75 80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Cys Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Ala Leu Asp100 105 110Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度330碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..330(D)其他信息/注＝“来自pCIB4616的2B5轻链可变区”(xi)序列描述SEQ ID NO7GAT ATC GTG ATG ACC CAG TCT CCT GCT TCC TTA GCT ATA TCT CTG GGG 48Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ile Ser Leu Gly1 5 10 15CAG AGG GCC ACC ATC TCA TAC AGG GCC AGC AAA AGT GTC AGT ACA TCT 96Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser20 25 30GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45AGA CTC CTC ATC TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TCT GGG GTC CCT GCC 192Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT 240Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG 288Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95GAG CTT ACA CGT TCG GAG GGG GGA CCA AAG CTG GAA ATA AAA 330Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度110氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO8Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ile Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser20 25 30Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度165碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..165(D)其他信息/注＝“ 17F6重链可变区”(xi)序列描述SEQ ID NO9TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACT ATT TCA AGA GAT GAT TCA CAA AGT ACT 48Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Thr1 5 10 15GTC TAC CTG GAG ATG AAC ACG CTA AGA GAG GAA GAC ACT GCC ACT TAT 96Val Tyr Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr20 25 30TAT TGT TGT AGA GGG GGG GAG GAG GGG TTT CCT TAC TGG GGG CAA GGG 144Tyr Cys Cys Arg Gly Gly Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly35 40 45ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 165Thr Leu Val Thr Val Ser Ala50 55(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度55氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO10Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Thr1 5 10 15Val Tyr Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr20 25 30Tyr Cys Cys Arg Gly Gly Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly35 40 45Thr Leu Val Thr Val Ser Ala50 55(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度339碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..339
(D)其他信息/注＝“17F6轻链可变区”(xi)序列描述SEQ ID NO11GAC ATC GTG CTG ACC CAA TCT CCA TCC TCC CTG AGT GTG TCA GTA GGA 48Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly1 5 10 15GAG AAG GTC ACC ATG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTT TTC GAC AGT 96Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser20 25 30GGA AAT CAA AAG AAC TCC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG CAG 144Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45CCT CCT AAA CTA TTG ATC TAC GGG ACA TCC ACT AGG GAT TCT GGG GTC 192Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val50 55 60CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACC GAT TTC ACT CTT ACC 240Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80ATC AGT GGT ATA CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG AAT 288Ile Ser Gly Ile Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95GAT CAT TAT TAT CCG TTC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAG ATA 336Asp His Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110AAA 339Lys(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度113氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO12Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Gly Ile Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Asp His Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征
(A)长度357碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟否(iv)反义否(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..357(D)其他信息/注＝“10B6重链可变区”(xi)序列描述SEQ ID NO13GAG GTG AAG GTG GAT GAG AGT GGG GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT 48Glu Val Lys Val Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn1 5 10 15TCT CTG AAA CTC TCC TGT GAA ACC TCG GGA TTC ACT TTC AGT TAT TAT 96Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr20 25 30TGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG AAG AGG CTG GAG TGG ATT 144Trp Met His Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45GCT GTG ATT AAA GTC AAA TCT GCT AAT TAT GGA TCA AAT TAT GCA GAG 192Ala Val Ile Lys Val Lys Ser Ala Asn Tyr Gly Ser Asn Tyr Ala Glu50 55 60TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACT ATT TCA AGA GAT GAT TCA AAT AGC GGT 240Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Asn Ser Gly65 70 75 80GTC TAC CTG CAG ATG AAC AGA TTA AGA GAA GAA GAC ACT GCC ACT TAT 288Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr85 90 95TAT TGT AGT AGA GGG GGG GCC CCC GGG TTT CCT TAT TGG GGC CAA GGG 336Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Ala Pro Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度119氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO14Glu Val Lys Val Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr20 25 30Trp Met His Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45Ala Val Ile Lys Val Lys Ser Ala Asn Tyr Gly Ser Asn Tyr Ala Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Asn Ser Gly65 70 75 80Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr85 90 95Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Ala Pro Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度339碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..339(D)其他信息/注＝“10B6轻链可变区”(xi)序列描述SEQ ID NO15GAT ATC GTG ATC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTA AGT GTG TCT TTA GGA 48Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15GAG AAG GTC ACT TTG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTG TTT ACC GGT 96Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Thr Gly20 25 30GGA GAT CAA AAG AAC TCC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA GCA GGG CAG 144Gly Asp Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln35 40 45CCT CCT AGA CTG TTG ATC TAC GGG ACT TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC 192Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGA ACC GAT TTC ACT CTT GCC 240Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala65 70 75 80ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GGT TAT TAC TGT CAG AAT 288Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95GAT CAT AGT TAT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA ATG TTG GAA GTA 336Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Glu Val100 105 110AAA 339Lys(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度113氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO16Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Thr Gly20 25 30Gly Asp Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln35 40 45Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Glu Val100 105 110Lys(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度1797碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..1797(D)其他信息/注＝“来自pCIB4631的3B1单链抗体”(xi)序列描述SEQ ID NO17ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA GCT GCA GGT 48Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Gly1 5 10 15GTC CAT TGC CTA CTC GAG GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CCA GCT TCT 96Val His Cys Leu Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser20 25 30TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC 144Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser35 40 45GAA AGT GTT GAT CAT TAT GAC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG 192Glu Ser Val Asp His Tyr Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln50 55 60AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAC CAA 240Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln65 70 75 80GGA TCC GGG GTC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 288Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95TTC AGC CTC AAC ATC CAT CCT ATG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATA TAT 336Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Ile Tyr100 105 110TTC TGT CAG CAA AGT AGG GAA CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC 384Phe Cys Gln Gln Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr115 120 125ACG CTG GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT AGA TCT GGT GGC 432Thr Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Arg Ser Gly Gly130 135 140GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG TCG CTC GAG CAG GTC AAA CTG CAG GAG 480Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gln Val Lys Leu Gln Glu145 150 155 160TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG TCA TTG AAA CTC TCA TGT 528Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys165 170 175GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAC TTC GCC ATG AAC TGG GTC CGC 576Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe Ala Met Asn Trp Val Arg180 185 190CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT GCT CGC ATA AGA AGT AAA 624Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys195 200 205AGT AAT AAT TAT GCA ACA TCT TAT GGC GAT TCA GTG AAA GAC AGG TTC 672Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe210 215 220ACC GTC TCC AGA GAT GAT TCA CAA AGC ATG TTC TAT CTG CAA ATG AAC 720Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met Phe Tyr Leu Gln Met Asn225 230 235 240AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT GTG AGG GTA GTA 768Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Val Val245 250 255TAC GGT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC 816Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser260 265 270TCA GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT 864Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser275 280 285AGA TCT GCT GCC CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC 912Arg Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val290 295 300AAG GGC TAT TTC CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCC 960Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser305 310 315 320CTG TCC AGC GGT GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC1008Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu325 330 335TAC ACT CTG AGC AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC1056Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser340 345 350GAG ACC GTC ACC TGC AAC GTT GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAG GTG1104Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val355 360 365GAC AAG AAA ATT GTG CCC AGG GAT TGT GGT TGT AAG CCT TGC ATA TGT1152Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys370 375 380ACA GTC CCA GAA GTA TCA TCT GTC TTC ATC TTC CCC CCA AAG CCC AAG1200Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys385 390 395 400GAT GTG CTC ACC ATT ACT CTG ACT CCT AAG GTC ACG TGT GTT GTG GTA 1248Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val405 410 415GAC ATC AGC AAG GAT GAT CCC GAG GTC CAG TTC AGC TGG TTT GTA GAT 1296Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp420 425 430GAT GTG GAG GTG CAC ACA GCT CAG ACG CAA CCC CGG GAG GAG CAG TTC 1344Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe435 440 445AAC AGC ACT TTC CGC TCA GTC AGT GAA CTT CCC ATC ATG CAC CAG GAC 1392Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp450 455 460TGG CTC AAT GGC AAG GAG TTC AAA TGC AGG GTC AAC AGT GCA GCT TTC 1440Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe465 470 475 480CCT GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA ACC AAA GGC AGA CCG AAG 1488Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys485 490 495GCT CCA CAG GTG TAC ACC ATT CCA CCT CCC AAG GAG CAG ATG GCC AAG 1536Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys500 505 510GAT AAA GTC AGT CTG ACC TGC ATG ATA ACA GAC TTC TTC CCT GAA GAC 1584Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp515 520 525ATT ACT GTG GAG TGG CAG TGG AAT GGG CAG CCA GCG GAG AAC TAC AAG 1632Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
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(A)长度72碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于制备pCIB4612 71bp Xho I/Dde I片段的寡核苷酸KE111A28(xi)序列描述SEQ ID NO21TCGAGGGTAC CGAGCTAG ATCTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA 60TCTGGAGGTG CC 72(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度71碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于制备pCIB4612 71bp Xho I/Dde I片段的寡核苷酸KE112A28(xi)序列描述SEQ ID NO22TGAGGCACCT CCAGATGTTA ACTGCTCACT GGATGGTGGG AAGATGGATA CAGATCTAGA 60GCTCGGTACC C71(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度41碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于制备pCIB4611 40bp Xho I/Nco I片段的寡核苷酸KE106A28(xi)序列描述SEQ ID NO23TCGAGGGTAC CGAGCTCTAG ATCTGCTGCC CAAACTAACT C 41(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度41碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于制备pCIB4611 40bp Xho I/Nco I片段的寡核苷酸KE107A28(xi)序列描述SEQ ID NO24CATGGAGTTA GTTGGGCAG CAGTCTAGA GCTCGGTACC C 41(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度39碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于制备pCIB4611 40bp BSt XI/Bam HI片段的寡核苷酸KE108A28(xi)序列描述SEQ ID NO25CTGGTAAAAGG CGGCCGCATC GATTAAGTCG ACCCGCGGG 39(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度47碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于制备pCIB4611 40bp Bst XI/Bam HI片段的寡核苷酸KE105A28(xi)序列描述SEQ ID NO26GATCCCCGCG GGTCGACTTA ATCGATGCGG CCGCCTTTAC CAGGAGA 47(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度7碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于pCIB4610的植物保守的翻译起始序列(xi)序列描述SEQ ID NO27AACAATG 7(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度7碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于pCIB4600的植物保守的翻译起始序列(xi)序列描述SEQ ID NO28TCCGATG 7(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于产生pCIB4610的83bp片段的PCR引物KE102A28(xi)序列描述SEQ ID NO29CGAAGTTAACAGATCTAGAGCTCGG 25(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于产生pClB4610的83bp片段的PCR引物KE101A28(xi)序列描述SEQ ID NO30CGGGATCCAACAATGGGATGGAGCTGGATCTT32(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度164碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述编码内质网信号肽的寡核苷酸，Kabat等，1987(xi)序列描述SEQ ID NO31GATCCAACAA TGGGATGGAG CTGGATCTTT CTCTTCCTCC TGTCAGTTGT TACCCTACCT 60CGACCTAGAA AGAGAAGGAG GACAGTGGAG CTGCAGGTGT CCATTGCCTA CTCGAGGGTA 120CCGAGCTCCT CGACGTCCAC AGGTAACGGA TGAGCTCCGA TGGC 164(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)长度10氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(v)片段类型内部(ix)特征(A)名称/关键词结构域(B)位置1..10
(D)其他信息/注＝“轻链和重链Fv片段之间的10氨基酸接头”(xi)序列描述SEQ ID NO32Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于产生pCIB4631的36bp片段的寡核苷酸KE147A28(xi)序列描述SEQ ID NO33GATCTGGTGG CGGTGGCTCG GGCGGTGGTG GGTCGC 36(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于产生pCIB4631的36bp片段的寡核苷酸KE182A28(xi)序列描述SEQ ID NO34TCGAGCGACC CACCACCGCC CGAGCCACCG CCACCA 36(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征
(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于产生与PE40融合的3B1单链抗体编码基因的700bp片段的PCR引物NC200(xi)序列描述SEQ ID NO35CGAAGCTTGA CATTGTGCTG ACCCAG26(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于产生与PE40融合的3B1单链抗体编码基因的700bp片段的PCR引物NC202(xi)序列描述SEQ ID NO36GCCCTCTAGA AGCATGCCTG AGGGACGGT GACTGA 36(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸
(A)描述用于扩增抗体基因的PCR引物NC92(xi)序列描述SEQ ID NO37GTCTCGAGGA YATYSWGMTS ACCCARTCT 29(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于扩增抗体基因的PCR引物NC130(xi)序列描述SEQ ID NO38GCAGATCTAG TTGGTGCAGC ATCAGCCCG 29(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于扩增抗体基因的PCR引物NC91(xi)序列描述SEQ ID NO39GTCTCGAGCA GGTSMARCTG CAGSAGTCWG30(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)长度29碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于扩增抗体基因的PCR引物NC114(xi)序列描述SEQ ID NO40GCAGATCTAG ATCCAGGGGC CAGTGGATA 29(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于扩增抗体基因的PCR引物NC111(xi)序列描述SEQ ID NO41GCAGATCTGC AGGAGACGAG GGGGAAGACA TT 32(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于扩增抗体基因的PCR引物NC117(xi)序列描述SEQ ID NO42GCAGATCTGC AGCCAGGGAC CAAGGGATA 29(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假拟否(v)片段类型内部(ix)特征(A)名称/关键词结构域(B)位置1..22(D)其他信息/注＝“轻链和重链Fv片段之间的另一可替代使用的接头”(xi)序列描述SEQ ID NO43Gly Pro Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro1 5 10 15Thr Pro Ser Gly Pro Gly20(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)长度357碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟否(iv)反义否(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..357(D)其他信息/注＝“pCIB4635的14G1重链可变区”(xi)序列描述SEQ ID NO44GAG GTG AAG CTT GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT 48Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn1 5 10 15TCT CTG AAA CTC TCC TGT GTT ACC TCG GGA TTC ACT TTC AGT AAC TAC 96Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30CGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG AAG AGG CTG GAG TGG ATT 144Arg Met His Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45GCT GTA ATT ACA CTC AAA TCT GAT AAT TAT GGA ACA ATT TAT GCA GAA 192Ala Val Ile Thr Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Gly Thr Ile Tyr Ala Glu50 55 60TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACC ATT TCA AGA GAA GAT TCA GAA AGC AGC 240Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Glu Ser Ser65 70 75 80ATC TAC CTG CAG ATG AAC AGA TTA AGA GAG GAA GAC ACT GCC ACT TAT 288Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr85 90 95TAC TGT AGT AGA GGT AGT GAC TGG GGA TTT CCT TAT TGG GGG CAA GGG 336Tyr Cys Ser Arg Gly Ser Asp Trp Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110ACT CTG GTC ACT GTG TCT GCA 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)长度119氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO45Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30Arg Met His Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45Ala Val Ile Thr Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Gly Thr Ile Tyr Ala Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Glu Ser Ser65 70 75 80Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr85 90 95Tyr Cys Ser Arg Gly Ser Asp Trp Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)长度339碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟否(iv)反义否(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..339(D)其他信息/注＝“pCIB4636的14G1轻链可变区”(xi)序列描述SEQ ID NO46GAT ATT GTG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG AGT GTG TCA GCA GGA 48Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly1 5 10 15GAG AAG GTC ACT ATG AAC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTG TTA AAT AGT 96Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30GGA AAT CAA AAG CAC TAC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGC CAG 144Gly Asn Gln Lys His Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45CCT CCT AAA CTG TTG ATC TAC GGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC 192Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGG TCT GGA ACC GAT TTC ACT CTT ACC 240Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT CAG AAT 288Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn85 90 95GAT CGT AGT TAT CCG TTC ACA TTC GCC TCG GGG ACA AAG TTG GAA ATA 336Asp Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110AAA 339Lys(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A)长度113氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO47Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys His Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn85 90 95Asp Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于扩增抗体基因的PCR引物DB91(iii)假拟否(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO48ACGTCTCGAG GARGTGAAGC TKRWKGARWC TG 32(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述用于扩增抗体基因的PCR引物DB114(iii)假拟否(iv)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO49CAATTCGCAT ATGAGATCCA GGGGCCAGTG GATA 3权利要求
1.能与靶昆虫的肠结合但不与哺乳动物刷状缘膜或植物微粒体结合的抗体或其片段。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或其结合片段。
3.权利要求2的单克隆抗体或其片段，其中所述单克隆抗体或其结合片段能与昆虫的刷状缘膜结合。
4.权利要求1或2的单克隆抗体，其中所述靶昆虫选自鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目和毛翅目。
5.权利要求4的单克隆抗体，其中所述靶昆虫是玉米根叶甲。
6.权利要求5的单克隆抗体，其中所述抗体选自2B5，3B1，10B6，17F6，14G1和16E4。
7.编码权利要求2-6任一项的单克隆抗体或所述单克隆抗体的结合位点的DNA序列。
8.权利要求7的DNA序列，其中所述DNA序列选自SEQ.ID.NO.1，3，5，7，9，11，13，15，17，44或46。
9.权利要求7或8的DNA序列，其中所述DNA序列与编码毒素部分的DNA序列有效地连接。
10.权利要求9的DNA序列，其中所述毒素部分选自芽孢杆菌毒素、假单胞菌内毒素、商陆素、gelonin、核糖核酸酶或核糖体灭活蛋白。
11.权利要求7-10任一项的DNA序列，其中所述DNA是植物基因组的一部分。
12.一种杂合毒素，其包括能与靶昆虫的肠结合但不与哺乳动物刷状缘膜或植物微粒体结合的抗体或其片段和与其有效地连接的毒素部分。
13.一种杂合毒素分子，所述分子包含权利要求2的单克隆抗体或单克隆抗体结合片段和与其有效地连接的毒素部分。
14.权利要求12或13的杂合毒素，其中所述毒素部分选自芽孢杆菌毒素、假单胞菌内毒素、商陆素、gelonin、核糖核酸酶或核糖体灭活蛋白。
15.权利要求14的杂合毒素，其中所述芽孢杆菌毒素选自芽孢杆菌内毒素和营养期杀虫蛋白。
16.权利要求15的杂合毒素，其中所述芽孢杆菌内毒素是Bt内毒素。
17.权利要求12的杂合毒素，其中所述单克隆抗体是权利要求2-6中任一项的抗体。
18.权利要求17的杂合毒素，其中所述单克隆抗体或其结合区能与昆虫的刷状缘膜结合。
19.权利要求18的杂合毒素，其中所述单克隆抗体选自2B5，3B1，10B6，17F6，14G1和16E4。
20.编码权利要求12-19中任一项的杂合毒素的DNA序列。
21.权利要求20的DNA序列，该序列是植物基因组的一部分。
22.由第一表达盒组成的DNA序列，该表达盒包括编码能够指导在植物中表达的启动子的DNA序列和与其有效连接的编码单克隆抗体轻链或抗体结合域的DNA序列，其中所述单克隆抗体与靶昆虫的肠结合。
23.权利要求22的DNA序列，其中所述表达盒还包括与编码单克隆抗体轻链或抗体结合域的DNA序列有效连接的编码毒素部分的DNA序列。
24.包含第二表达盒的DNA序列，该表达盒包括编码能够指导在植物中表达的启动子的DNA序列和与其有效连接的编码单克隆抗体重链或抗体结合域的DNA序列，其中所述单克隆抗体与靶昆虫的肠结合。
25.权利要求24的DNA序列，其中所述表达盒还包括与编码单克隆抗体重链或抗体结合域的DNA序列有效连接的编码毒素部分的DNA序列。
26.权利要求22-25中任一项的DNA序列，其还包含在植物中有效的终止序列。
27.权利要求23或26的DNA序列，其中所述毒素部分选自芽孢杆菌毒素、假单胞菌内毒素、商陆素或核糖核酸酶。
28.权利要求22-27中任一项的DNA序列，其中所述DNA序列是植物基因组的一部分。
29.用权利要求7-11和20-21中任一项的DNA序列转化的植物细胞。
30.用权利要求22-28中任一项的DNA序列转化的植物细胞。
31.用权利要求7-11和20-21中任一项的DNA序列转化的植物和其后代。
32.用权利要求22-28中任一项的DNA序列转化的植物和其后代。
33.表达权利要求1-6中任一项的单克隆抗体的植物和其后代。
34.表达权利要求12-19中任一项的杂合毒素的植物和其后代。
35.权利要求31-34任一项的植物，它是玉米植物。
36.权利要求31-35任一项的植物，它是杂种植物。
37.用保护剂包衣处理过的权利要求31一36任一项中植物的繁殖材料。
38.权利要求37的繁殖材料，其包含选自除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或其混合物的制剂。
39.权利要求37或38的繁殖材料，其特征在于它由种子组成。
40.用权利要求7-11和20-21中任一项的至少一种DNA序列转化的重组微生物。
41.用权利要求22-28中任一项的至少一种分离DNA序列转化的重组微生物。
42.包含至少一种编码杂合毒素的DNA分子的重组微生物，其中杂合毒素包括与靶昆虫的肠结合但不与哺乳动物刷状缘膜或植物微粒体结合的抗体或其片段和与其有效地连接的毒素部分，所述编码单克隆抗体的DNA序列包含选自SEQ ID No.1，3，5，7，9，11，13，15，17，44或46的序列。
43.权利要求40-42任一项的重组微生物，其中所述重组微生物选自细菌如芽孢杆菌、柄杆菌、Agmenellum、假单胞菌、欧文氏菌、沙雷氏菌、科雷伯氏菌、黄单胞菌、链霉菌、根瘤菌、红假单胞菌、Metylius、农杆菌、醋杆菌、乳杆菌、节杆菌、固氮菌、明串珠菌和产碱菌；真菌特别是酵母如酵母、隐球酵母、克鲁维酵母、掷孢酵母、红酵母和短梗霉；病毒如苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒。
44.含有杀虫有效量的权利要求40-43任一项的重组微生物和适当载体的杀虫组合物。
45.含有杀虫有效量的权利要求12-19任一项的分离的杂合毒素分子和适当载体的杀虫组合物。
46.用权利要求44-45任一项的杀虫组合物处理过的植物繁殖材料。
47.权利要求46的繁殖材料，其特征在于它是植物种子。
48.一种稳定转化宿主生物的方法，包括将权利要求7-10或21或23-25或27-29中任一项的DNA序列引入所述宿主生物的基因组中。
49.权利要求33的方法，其中所述宿主生物是微生物。
50.权利要求33的方法，其中宿主生物是植物。
51.产生权利要求1的抗体或单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备方法，其包括a)用昆虫肠，特别是昆虫刷状缘膜作为抗原；b)用所述抗原免疫供体动物；c)从被免疫的供体动物分离免疫成分B细胞；d)将所述免疫成分B细胞与能进行连续细胞分裂的肿瘤细胞融合；e)分离形成的融合产物，在适当的培养基中培养，然后克隆阳性杂合细胞；和f)将克隆的杂合细胞按产生单克隆抗体的能力进行筛选，选择具有所要求性质的克隆。
52.权利要求11-20的杂合抗体一毒素分子的构建方法，包括克隆抗体的可变区并将该区与毒素部分连接。
53.一种制备能结合昆虫肠刷状缘膜小泡的单克隆抗体或其片段的方法，包括在适当的培养基中体内或体外培养产生所述抗体的杂交瘤细胞系，并分离形成的抗体。
54.一种产生编码权利要求1单克隆抗体的DNA序列的方法，包括利用针对恒定区和可变区的支架区中保守DNA序列的引物从杂交瘤细胞分别克隆抗体基因。
55.产生权利要求2-6任一项的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
56.权利要求55的杂交瘤细胞系，其已按下列保藏号保藏ATCC HB11616，HB 11617，HB 11618，HB 11619和HB 11620。
全文摘要
提供了能与昆虫肠的刷状缘膜小泡结合的抗体、单克隆抗体或其片段和编码这些蛋白质的基因。该单克隆抗体与靶昆虫的肠结合但不与哺乳动物刷状缘膜或植物微粒体结合。这些抗体和编码它们的基因可用于构建防治害虫的杂合毒素。
文档编号C07K14/325GK1151759SQ95193817
公开日1997年6月11日 申请日期1995年6月20日 优先权日1994年6月28日
发明者N·B·卡洛茨, M·G·库斯艾尔 申请人:希巴-盖吉股份公司