用于昆虫控制的cry1i蛋白和基因的制作方法

专利名称：用于昆虫控制的cry1i蛋白和基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学的领域。提供了新颖的编码杀虫蛋白的基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列在制备杀虫制剂中以及在转基因抗虫植物的生产中是有用的。背景苏云金芽孢杆菌(Bt)是一种革兰氏阳性的产芽孢土壤细菌，其特征在于它产生晶体包含体的能力，晶体包含体对于某些目和种类的昆虫是明确有毒的，但是对于植物和其他非靶标生物是无害的。出于这个原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀虫蛋白的组合物可以用作环境上可接受的杀虫剂以控制农业害虫或针对许多种人或动物疾病的昆虫载体。从苏云金芽孢杆菌衍生的、通常被称为“Cry蛋白”的杀虫晶体蛋白的用途已经被采用。Cry蛋白是在Bt的芽孢形成后期期间以结晶形式积聚为原毒素的球状蛋白质分子。在被害虫摄取之后，这些晶体被溶解从而在幼虫的碱性中肠环境中释放原毒素。原毒素(大约130-140kDa)经由肠蛋白酶转化为成熟的毒性片段(大约60-70kDa N末端区域)。这些蛋白质的许多对于特异性靶标昆虫具有很强的毒性，但是对于植物和其他非靶标生物是无害的。来自苏云金芽孢杆菌的Cry蛋白主要针对鳞翅目、双翅目、以及鞘翅目幼虫具有有力的杀虫活性。这些蛋白质还已经显示针对其他昆虫目的活性，例如膜翅目、同翅目、虱目、食毛目、以及蜱螨亚纲害虫目(Acari pest order)、连同其他的无脊椎动物目(例如线形动物门、扁形动物门、以及肉鞭动物亚门(Sarcomastigorphora))(斐特尔森(Feitelson) (1993)，“在先进的工程化杀虫剂中的苏云金芽孢杆菌家族树”(The BacillusThuringiensis family tree.1n Advanced Engineered Pesticides.)Marcel Dekker 公司，纽约，纽约州)。这些蛋白质最初主要基于它们的杀虫活性而被分类为CryI至CryVI。主要类别是鳞翅目特异的(I)、鳞翅目和双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)、以及线虫特异的(V)和(VI)。这些蛋白质进一步被分类为亚家族，在各个家族之内的更高度相关的蛋白质被指定了区分字母，例如CryIA、CryIB、CryIC，等等。在各个区分之内的甚至更紧密相关的蛋白质被给定名称，例如CryIC(a)、CryIC(b)等等。术语“Cry毒素”以及“ δ -内毒素”与术语“Cry蛋白”可互换地使用。已经描述了一种新的针对Cry基因的命名法，这种命名法基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性(克里克莫尔(Crickmore)等人，1998，《微生物学与分子生物学评论》(Microbiol.Mol.Biol.Rev)62:807-813)。在这种更可接受的分类中，每种毒素被指定一个唯一的名称，该名称结合了初级等级(一个阿拉伯数字)、二级等级(一个大写字母)、三级等级(一个小写字母)、以及四级等级(另一个阿拉伯数字)。在新的分类中，在初级等级中的罗马数字已经被调换为阿拉伯数字。Cry蛋白通常 具有五个保守序列结构域、以及三个保守结构域(参见，例如，deMaagd等人(2001)《遗传学趋势》(Trends Geneticsl7:193-199))。第一保守结构域包括七个α螺旋并且涉及膜插入和孔形成。结构域II包括三个安排为希腊钥匙构型(Greekkey configuration)的β片层，并且结构域III包括两个处于果冻卷(jelly-roll)构造的反平行β片层(de Maagd等人，2001，见上文)。结构域II和III涉及受体识别和结合，并且因此被考虑为毒素特异性的决定簇。另外，也已经从苏云金芽孢杆菌中分离出非内毒素基因和它们编码的蛋白质。不像Cry蛋白是在芽孢形成期间产生并且以一种伴孢晶体维持在细胞内，这些新的杀虫蛋白是在营养生长期期间从芽孢杆菌分泌的并且因此已经被指定为营养期杀虫蛋白(VIP)。(参见例如，美国专利号 5,877,012 ;6，107，279 ;6，137,033 ;5，849，870 以及 5,889，174，通过引用结合在此)。CrylIa是一种独特的来自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，其中它具有类似于Cry和VIP两者的生物化学特性。CrylIa具有其他Cry蛋白的保守结构域但不是在伴孢晶体中产生。在CrylIa型蛋白不存在于伴孢晶体中的基础上，以前的报道已经表明crylla型基因的隐含性质。Kostichka等人(1996.《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)178:2141-2144)首先报道了 CrylIa的分泌以及CrylI的N末端结构域的存在,该N末端结构域可能充当分泌信号肽。以前的报道已经显示，CrylIa针对鳞翅目和鞘翅目昆虫两者都是有活性的。众多商业上有价值的植物，包括普通的农作物，易受昆虫害虫和线虫害虫攻击的影响，引起作物产量和质量的大幅度降低。例如，玉米(玉蜀黍)种植者面临一个对抗害虫侵染的重大问题。线虫和昆虫，包括鳞翅目和鞘翅目昆虫，在美国每年破坏估算的15%的农作物，而在发展中国家甚至占更大的百分比。另外，与杂草以及寄生和腐生植物的竞争说明甚至更多的潜在的产量损失。每年，仅在美国，此类害虫导致作物损失超过1000亿美元。在对抗害虫侵染的努力中，已经使用了各种方法，以便减少或消除在特定地块中的害虫。这些努力包括将玉米与不是特定害虫的宿主的其他作物轮作，并且将杀虫剂施用至作物的地上部分， 将杀虫剂施用至受累作物的根系之中和其周围的土壤。传统地，农民已经非常依赖于化学杀虫剂来对抗害虫损害。然而，由于农民在每个生长季节施用数十亿加仑的合成杀虫剂来对抗这些害虫，花费将近80亿美元，化学杀虫剂的使用是昂贵的。另外，此类杀害虫剂对于农民是不方便的，导致抗杀虫剂害虫的出现，并且它们引发了显著的环境和健康问题。作为这些问题以及杀害剂的成本的结果，存在着一种针对用于农作物的替代杀虫剂的需求。例如，结合了转基因基因(这些转基因基因导致玉米植物产生杀虫蛋白，提供针对目标害虫的保护)的玉米植物是一种更环境友好的控制害虫的途径。由于昆虫可以赋予的毁坏，对于发现新形式的具有不同作用模式的杀虫蛋白存在着一种连续的需要。概述本发明提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织以及种子的害虫抗性的组合物和方法。具体地说，提供了新颖的从苏云金芽孢杆菌分离的cryll核酸序列、以及基本上与其一致的序列，这些核酸序列的表达导致对经济上重要的害虫(特别是侵染植物的害虫)具有毒性的蛋白质。本发明进一步涉及由这些核酸序列的表达生成的新颖的CrylI毒素，并且涉及含有这些CrylI毒素的组合物和制剂，它们能够抑制害虫的生存、生长以及繁殖的能力或者能够限制昆虫相关的对作物植物的损害或损失。本发明还涉及使用这些核酸序列的方法，例如在DNA构建体或表达盒中用于在生物(包括微生物和植物)中的转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以是已经被设计用于在一种生物(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列，或者制成具有增强的杀虫活性的杂合毒素。本发明进一步涉及制造毒素的方法以及使用这些核酸序列例如在微生物中来控制昆虫或在转基因植物中赋予对抗害虫的保护的方法，并且涉及使用CrylI毒素、以及包含CrylI毒素的组合物和制剂的方法，例如将CrylI毒素或组合物或制剂施用至昆虫侵染的区域，或施用它们以预防性地处理易受昆虫影响的区域或植物从而赋予针对虫害的保护。核苷酸或氨基酸序列可以是已经被设计用于在一种生物(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。本发明还提供了包含编码本发明的CrylI毒素的核酸序列的转化的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。根据一个方面，本发明提供了一种包含719个氨基酸并且具有与SEQ ID N0:1至少99%的一致性的CrylI毒素，其中相应于位置140的氨基酸是谷氨酸(E)，相应于位置184的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置233的氨基酸是天冬氨酸(D)，相应于位置329的氨基酸是异亮氨酸(I)，相应于位置377的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置393的氨基酸是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)，相应于位置549的氨基酸是亮氨酸(L)，并且相应于位置712的氨基酸是亮氨酸(L)或谷氨酰胺(Q)。在另一方面，本发明提供了一种包含719个氨基酸并且具有与SEQ ID N0:1至少99%的一致性的CrylI毒素，其中在位置140处的氨基酸是谷氨酸(E)，在位置184处的氨基酸是苏氨酸(T)，在位置233处的氨基酸是天冬氨酸(D)，在位置329处的氨基酸是异亮氨酸(I)，在位置377处的氨基酸是苏氨酸(T)，在位置393处的氨基酸是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)，在位置549处的氨基酸是亮氨酸(L)，并且在位置712处的氨基酸是亮氨酸(L)或谷氨酰胺(Q)。在另一方面，CrylI毒素针对害虫，特别是鳞翅目害虫是有活性的。在另一方面，CrylI毒素仅仅对于鳞翅目害虫是有活性的。具体地，提供了相应于CrylI序列的核酸分子。另外，包括了相应于这些核酸分子的氨基酸序列。具体地说，本发明提供了分离的核酸分子，这些分离的核酸分子包括编码在SEQ ID N0:1或3中所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或在SEQ ID NO:2、4、5、或6中列出的核苷酸序列、以及它们的变体和片段。提供了用于产生本发明的多肽的、并且用于使用那些多肽用于控制或杀死鳞翅目害虫的方法。提供了用于与其他用来控制或杀死鳞翅目和鞘翅目害虫的多肽结合使用本发明的多肽的方法。本发明的组合物和方法对于具有杀虫剂抗性的生物(确切地为细菌和植物)的产生是有用的。这些生物以及从它们衍生的组合物用于农业目的是所希望的。本发明的组合物对于产生改变的或改进的具有杀虫活性的Cry毒素、或对于检测在产品或生物中的Cry毒素或核酸的存在也是有用的。本发明的另一方面是一种核酸分子，该核酸分子包含编码本发明的CrylI毒素的核苷酸序列。在另一方面，该核苷酸序列包括SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4。在又另一方面，该核苷酸序列已经针对在植物中的表达而被密码子优化。仍然在又另一方面，该核苷酸序列包括 SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6。本发明的又另一方面是一种嵌 合基因，该嵌合基因包括一种异源启动子序列，该异源启动子序列可操作地连接至SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5、或SEQ ID NO:6中的任何一个。在又另一方面，该启动子是一种植物表达性启动子。仍然在又另一方面，该启动子选自下组，该组由以下各项组成:泛素、cmp、玉米TrpA、细菌噬菌体T3基因95’ UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、豌豆小亚基RuBP羧化酶、Ti质粒甘露碱合成酶、Ti质粒胭脂碱合成酶、牵牛花查尔酮异构酶、大豆富含甘氨酸蛋白1、马铃薯块茎特异蛋白(patatin)、凝集素、CaMV35S、以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。本发明的再又另一方面是一种包含以上嵌合基因的重组载体。在另一方面，该载体是质粒、粘粒、噬菌粒、人工染色体、噬菌体或病毒载体。在另一方面，该载体被包含在转基因的非人类宿主细胞中。在另一方面，该宿主细胞是一种转基因植物细胞。在另一方面，该转基因植物细胞是玉米、小麦、水稻、大豆、烟草、或棉花。本发明的又另一方面是从以上转基因植物衍生的并且包括CrylI毒素的生物样品。在另一方面，该杀虫蛋白保护该生物样品免于昆虫侵染。在另一方面，生物样品是面粉、粗粉、油、或淀粉、或从任何这些生物样品衍生的产品。本发明的再又另一方面是一种为农民提供控制鳞翅目害虫的手段的方法，所述方法包括向农民供应或出售植物材料，所述植物材料包括一种能够表达如上所述的CrylI毒素的核酸分子。本发明的另一方面是产生本发明的CrylI毒素的方法，该方法包括以下步骤:(a)用一种包含编码该CrylI毒素的核苷酸序列的重组核酸分子转化一种非人类宿主细胞；并且(b)在步骤(a)的宿主细胞表达该重组核酸分子的条件下培养这种宿主细胞，由此产生CrylI毒素。在另一方面，该非人类宿主细胞是一种植物细胞。在另一方面，该植物细胞是一种玉米细胞。在又另一方面，该重组核酸分子针对在植物中的表达而被密码子优化。在另一方面，该重组核酸分子包括SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、或SEQ ID NO: 6。在另一方面，该重组核酸分子进一步包 括一种启动子序列，该启动子序列可操作地连接至所述核苷酸序列以允许由该宿主细胞进行的该核苷酸序列的表达以及该CrylI毒素的产生。在另一方面，转化是通过土壤杆菌介导的转化、电穿孔、或微粒轰击而进行的。本发明的另一方面是减少在转基因植物中由鳞翅目昆虫和鞘翅目昆虫引起的虫害的一种方法。这种方法包括:种植包含一个第一转基因和一个第二转基因的转基因植物种子，其中该第一转基因引起一种CrylI毒素的表达并且其中该第二转基因引起一种来自苏云金芽孢杆菌的毒素的表达；由此减少由鳞翅目昆虫和鞘翅目昆虫引起的对从该转基因植物种子生长的转基因植物的损害。在另一方面，该CrylI毒素包含719个氨基酸并且具有与SEQ ID NO:1至少99%的一致性，其中相应于位置140的氨基酸是谷氨酸(E)，相应于位置184的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置233的氨基酸是天冬氨酸(D)，相应于位置329的氨基酸是异亮氨酸(I)，相应于位置377的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置393的氨基酸是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)，相应于位置549的氨基酸是亮氨酸(L)，相应于位置712的氨基酸是亮氨酸(L)或谷氨酰胺(Q)。在另一方面，该第一转基因包括一种选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成:SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5以及SEQ ID N0:6。在另一方面，来自苏云金芽孢杆菌的毒素是Cry毒素或VIP毒素。在另一方面,该Cry毒素是一种Cry3毒素。在另一方面，该Cry3毒素是一种修饰的Cry3A毒素，如在美国专利号7，030，295和7，230，167中所描述的，通过引用以它们的全文结合在此。在另一方面，该转基因植物是玉米、小麦、水稻、大豆、烟草、或棉花。参考以下详细说明和权利要求书，本发明的这些和其他特征、方面、以及优点将变
得更好理解。在序列表中的序列的简要说明SEQ ID N0:1是5618-CrylIa毒素的氨基酸序列。SEQ ID NO: 2是编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列。SEQ ID NO: 3是5621-CrylIa毒素的氨基酸序列。SEQ ID NO:4是 编码SEQ ID NO:3的核苷酸序列。SEQ ID NO:5是编码5618-CrylIa的、密码子优化的核苷酸序列。SEQ ID NO:6是编码5621-CrylIa的、密码子优化的核苷酸序列。SEQ ID NO: 7 是 cryIB 编码序列。SEQ ID NO:8 是 cryIAc 启动子。SEQ ID NO:9是跨越SEQ ID NO:8的核苷酸1-20的引物。SEQ ID NO: 10 是跨越 SEQ ID NO:8 的核苷酸 179-188 的引物。定义“与之相关联/可操作地连接”是指物理上或功能上相关的两种核酸序列。例如，如果一个启动子或调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的一个DNA序列可操作地连接、或被定位为使得该调节DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平，则这两个序列被称为是“相关联”的。一个“嵌合基因”或“嵌合构建体”是一个重组核酸序列，其中一个启动子或调节核酸序列被可操作地连接至一个核酸序列上、或与其相关联，该核酸序列编码一种mRNA或被表达为一种蛋白质，使得该调节核酸序列能够调节该相关联的核酸编码序列的转录或表达。该嵌合基因的调节核酸序列通常不被可操作地连接至如在自然界所发现的结合的核酸序列上。“编码序列”是转录成RNA (如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的一个核酸序列。优选地，该RNA然后在生物中被翻译以产生一种蛋白质。如在此使用的，“密码子优化”表示一种重组的、转基因的、或合成的核苷酸序列，其中这些密码子被选择为反映宿主细胞可能具有的特定的密码子偏倚。这是以这样一种方式来完成的，该方式是为了保持由密码子优化的核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，该重组DNA构建体的DNA序列包括已经针对该构建体有待在其中表达的细胞(例如，动物、植物、或真菌细胞)而被密码子优化的序列。例如，一种有待在植物细胞中表达的构建体可以使它的全部或部分序列(例如，第一基因抑制元件或基因表达元件)针对在植物中的表达而被密码子优化。参见例如美国专利号6，121，014，通过引用结合在此。“控制”昆虫表示通过一种毒性作用抑制害虫存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，或限制与昆虫有关的损害或作物植物中的损失。“控制”昆虫可以表示或可以不是表示杀死昆虫，虽然它优选地表示杀死昆虫。在本发明的背景下，“相应于”表示当变体CrylI毒素的氨基酸序列彼此比对时，“相应于”在本发明中的某些列举的位置的这些氨基酸是与在CrylI毒素(SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3)中的这些位置比对的那些，但是在相对于本发明的特定CrylI氨基酸序列的这些确切数字位置中是不必要的。“递送”一种毒素表示使该毒素与一种昆虫相接触，产生毒性作用和对昆虫的控制。这种毒素可以按照许多公认的方式进行递送，例如，通过昆虫经口摄入或通过经由转基因植物表达、一种或多种配制的蛋白质组合物、一种或多种可喷洒的蛋白质组合物、一种饵基、或任何其他的领域公认的毒素递送系统与昆虫接触。“有效昆虫控制量”是表示通过一种毒性作用抑制昆虫存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，或限制与昆虫有关的损害或作物损失的毒素的浓度。“有效昆虫控制量”可以表示或可以不表示杀死昆虫，虽然它优选地表示杀死昆虫。如在此使用的“表达盒”表示能够在一种适当的宿主细胞中指导特定的核苷酸序列的表达的核酸序列，包含一个启动子，该启动子可操作地连接至所感兴趣的核苷酸序列上，该核苷酸序列可操作地连接至终止信号上。它还典型地包含正确翻译该核苷酸序列所需要的序列。包含该感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，表示至少一个它的组分相对于至少一个它的其他组分是异源的。该表达盒还可以是一种天然发生的表达盒，但已经以对于异源表达有用的重组形式而获得。然而，典型地，该表达盒相对于宿主而言是异源的，即该表达盒的特定核酸序列并不天然发生于该宿主细胞中，并且必须已经通过一个转化事件引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先(ancestor)中。在该表达盒中核苷酸序列的表达可以是在一个组成型启动子或一个诱导型启动子的控制之下，只有当该宿主细胞暴露于一些特定的外界刺激时该启动子才引发转录。在多细胞生物(如一种植物)的情况下，该启动子还可能对于特定组织、或器官、或者发育阶段是特异性的。“基因”是一个限定的区域，该区域位于一个基因组之内，并且除了前述的编码序列之外，它还包含其他负责该编码部分的表达控制(也就是转录和翻译)的核酸序列。一个基因还可以包含其他5’和3’未翻译序列和终止序列。其他可能存在的元件是，例如，内含子。“感兴趣的基因”是指当该基因转移至一种植物时，在该植物上赋予一种所希望的特征(例如抗生素抗性 、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其他害虫的抗性、除草剂耐受性、改进的营养价值、改进的工业过程的性能或者改变的繁殖能力)的任何基因。“感兴趣的基因”还可以是被转移至植物用于在该植物中产生商业上有价值的酶或代谢物的一种基因。“肠蛋白酶”是在昆虫的消化道中天然发现的一种蛋白酶。这种蛋白酶通常涉及摄入的蛋白质的消化。“异源”核酸序列是一个不与将该核酸序列引入其中的宿主细胞天然地相关联的核酸序列，包括天然发生的核酸序列的非天然发生的多拷贝。“同源”核酸序列是与将该核酸序列引入其中的宿主细胞天然地关联的核酸序列。“同源重组”是在同源核酸分子之间的核酸片段的相互交换。“杀虫”被定义为能够控制昆虫(优选地通过杀死它们)的有毒的生物活性。“分离的”核酸分子或分离的毒素是通过人工离开其天然环境中而存在的一种核酸分子或毒素并，因此不是自然的产物。一种分离的核酸分子或毒素可以按照一种纯化的形式而存在、或可存在于一种非天然的环境(例如一种重组的宿主细胞或一种转基因植物)中。
“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源分离的单链或双链DNA或RNA。在本发明的背景中，该核酸分子优选地是一个DNA区段。“植物”是在任何发育阶段的任何植物，特别是一种种子植物。“植物细胞”是一种植物的结构和生理学单位，包括一个原生质体和一个细胞壁。植物细胞可以处于一种分离的单细胞或一种培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(例如，植物组织、植物器官、或整株植物)的一部分。“植物细胞培养物”表示植物单元(例如像，原生质体，细胞培养的细胞，在不同发育阶段的植物组织、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子、以及胚中的细胞)的培养物。“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或一种植物的任何其他部分或产物。“植物器官”是一种植物的一个不同且明显结构化并且分化的部分，例如，根、茎、叶、花芽、或胚。如在此使用的“植物组织”表示被组织成一个结构和功能单元的一组植物细胞。包括在培养物或在植物中的任何植物组织。本术语包括但不局限于:整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织成结构和/或功能单元的任何植物细胞群。本术语与如以上所列出的任何特异类型的植物组织一起(或在其缺乏下)使用、或通过由这项定义所涵盖的其他方式的使用并非旨在排除任何其他类型的植物组织。“启动子”是一个编码区上游的未翻译DNA序列，它包含RNA聚合酶结合位点并且起始DNA的转录。启动子区域也可包括充当基因表达的调节物的多个其他的元件。“原生质体”是一种分离的植物细胞，没有细胞壁或仅具有细胞壁的部分。
`
“调节元件”是指涉及控制核苷酸序列的表达的序列。调节元件包括一个可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列和终止信号上的启动子。它们还典型地包括正确翻译该核苷酸序列所需要的序列。基本上一致的:在两个核酸或蛋白质序列的背景下，短语“基本上一致的”是指两个或更多个序列或子序列，当针对最大对应性进行比较和比对时，这些序列或子序列具有至少60%、优选80%、更优选90、甚至更优选95%、并且最优选至少99%的核苷酸或氨基酸残基一致性，正如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查所测量的。优选地，该基本上的一致性存在于在长度上为至少大约50个残基的序列的区域上、更优选地在至少大约100个残基的区域上，并且最优选地这些序列在至少大约150个残基上是基本上一致的。在一个特别优选的实施例中，这些序列在编码区的整个长度上基本上是一致的。此外，基本上一致的核酸或蛋白质序列基本上执行相同的功能。为了序列比较，典型地一个序列充当测试序列与其比较的参考序列。当使用一种序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到电脑中(若有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，这种序列比较算法基于所指定的程序参数来计算这个或这些测试序列相对于该参考序列的序列一致性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过Smith &Waterman,《应用数学进展》(Adv.Appl.Math.> 2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman & Wunsch,《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.>48:443 (1970)的同源比对算法、通过 Pearson & Lipman,《美国国家科学院院刊》(Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA)85:2444 (1988)的相似性方法的搜索，通过这些算法(Wisconsin Genetics Software Package, GeneticsComputer Group, 575Science Dr.，Madison, Wis 中的 GAP、BESTFIT、FASTA、以及 TFASTA)的计算机化实施，或通过目视检查(总体上，参见Ausubel等人,下文)。—种适合于确定序列一致性百分比以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，它描述于 Altschul et al.，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.>215:403-410 (1990) 执行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(the National Center forBiotechnology Information,美国国家医学图书馆(U.S.National Library ofMedicine), 8600Rockville Pike, Bethesda, MD20894USA)是可公开获得的。这种算法涉及首先通过识别在查询序列中的长度为W的短字来识别高分序列对(HSP)，当与数据库序列中的一个同样长度的字进行比对时，它们或者匹配抑或满足一些正值阈值得分T。T被称为相邻字分值阈值(neighborhood word score threshold) (Altschul et al.，1990)。这些初始相邻字命中充当用于引起搜索以发现含有它们的较长的HSP的种子。然后，将这些命中字在两个方向上沿着每个序列延长直到该累积的比对得分可以被增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖励分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是〈O)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用一种得分矩阵来计算累积得分。当累积比对得分从它的最大获得值以数量X下降时，这些字命中在每个方向上的延伸被停止，该累积得分变为O或以下，这是由于一个或多个负得分残基比对的累积、或达到任一序列的末尾所致。BLAST算法参数W、T、和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W) 11、期望值(E) 10、截止值100、M=5、N=-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W) 3、期望值(E) 10、以及BL0SUM62得分矩阵作为默认值(见Henikoff & Henikoff,《美国国家科学院院刊》89:10915 (1989))。除了计算序列一致性百分比之外，BLAST算法还进行在两个序列之间的相似性的统计分析(见，例如Karlin & Altschul，《美国国家科学院院刊》90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法提供的相似性的量度是最小合计概率(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生的匹配的概率的一个指示。例如，如果在一个测试核酸序列与一个参考核酸序列的比较中该最小合计 概率小于大约0.1、更优选地是小于大约0.01、并且最优选地是小于大约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参考序列相类似的。两个核酸序列基本上是一致的另一种指示在于这两种分子在严紧条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”是指当序列存在于一种复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时，一种分子在严紧条件下仅仅与一种特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交。“基本上结合”是指在一个探针核酸与一个目标核酸之间的互补杂交，并且包含少量的错配，这些错配可通过降低杂交介质的严紧度而调节，以实现所希望的目标核酸序列的检测。在核酸杂交实验的背景下(例如，Southern和Northern杂交)“严紧杂交条件”和“严紧杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异地杂交。对核酸杂交的一种广泛指导发现于蒂森(Tijssen) (1993)的生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针的杂交第2章第I部分(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes part I chapter2) “杂交的原理以及核酸探针测定的策略综述”("Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays'爱思唯尔，纽约)。通常，对于在一个限定的离子强度和pH下的特异序列，高严紧杂交和洗涤条件被选择为比热熔点(Tm)大约低5° C。典型地，在“严紧条件”下，一种探针将会与它的目标子序列杂交，但不会与其他序列杂交。Tm是50%的目标序列与一种完全匹配的探针杂交所处的温度(在限定的离子强度和pH下)。极度严紧条件被选择为等于针对一种特定探针的Tm。对于互补核酸(它们在Southern或Northern印迹中在滤器上具有超过100个互补的残基)的杂交的严紧杂交条件的一个实例是在42° C下、具有Img肝素的50%甲酰胺、使杂交进行过夜。高严紧洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl在72° C下大约15分钟。严紧洗涤条件的一个实例是在65° C下，0.2 X SSC洗涤持续15分钟(参见，Sambrook，下文，对于SSC缓冲剂的说明)。通常，在高严紧洗涤之前会先进行低严紧洗涤，以便去除背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双链体的示例性中等严紧洗涤是I X SSC，在45° C持续15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链体的低严紧洗涤的一个实例是在40° C下的4-6 X SSC持续15分钟。对于短探针(例如，大约10-50个核苷酸)，严紧条件典型地涉及小于大约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在PH7.0至8.3下大约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度典型地是至少大约30° C。严紧条件还可以用添加去稳定剂(例如，甲酰胺)来实现。一般而言，相比于无关探针，在特定的杂交测定中观察到高出2倍(或更高)的信噪比表明检测到一个特异性杂交。如果它们编码的蛋白质是基本上一致的，这些在严紧条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本上一致的。例如，当使用该遗传密码允许的最大程度的密码简并而产生一个核酸的拷贝时，则发生这种情况。以下是可以 用来克隆同源核苷酸序列(这些序列是与本发明的参考核苷酸序列基本上一致的)的多组杂交/洗涤条件的实例:一种参考核苷酸序列在以下条件下优选地与参考核苷酸序列杂交:在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA中在50° C下，并且在2XSSC、0.1%SDS中在50° C下洗涤；更令人希望的是在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA中在50° C下，并且在I XSSC、0.1%SDS中在50° C下洗涤；仍然更令人希望的是在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA中在50° C下，并且在0.5XSSC、0.1%SDS中在50° C下洗涤；优选在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4'ImMEDTA中在50° C下，并且在0.1 X SSC、0.1%SDS中在50° C下洗涤；更优选在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA 中在 50° C 下，并且在 0.1 X SSC、0.1%SDS 中在65° C下洗涤。两个核酸序列或蛋白质基本上是一致的另一个指示是指由该第一核酸编码的蛋白质与由该第二核酸编码的蛋白质免疫交叉反应或与其特异性结合。因此，一种蛋白质典型地是与一种第二蛋白质基本上一致的，例如在这两种蛋白质仅仅在保守性取代方面不同的情况下。“转化”是一种用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物中的方法。具体地，“转化”表示DNA分子稳定整合到一种感兴趣生物的基因组中。“转化的/转基因的/重组的”是指其中引入了一种异源核酸分子的宿主生物，例如一种细菌或一种植物。该核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者该核酸分子还可以作为一种染色体外分子存在。这样一种染色体外分子能够自动复制。转化的细胞、组织或者植物应当理解为不仅包含一个转化过程的终产物，而且包含其转基因子代。一种“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指一种不含有异源核酸分子的野生型生物，例如一种细菌或植物。通过以下标准缩写由核苷酸的碱基来指示核苷酸:腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。同样，氨基酸由以下标准缩写来表示:丙氨酸(Ala ;A)、精氨酸(Arg ;R)、天冬酰胺(Asn ;N)、天冬氨酸(Asp ;D)、半胱氨酸(Cys ;C)、谷氨酰胺(Gin ;Q)、谷氨酸(Glu ;E)、甘氨酸(Gly ;G)、组氨酸(His ;H)、异亮氨酸(lie ;1)、亮氨酸(Leu ;L)、赖氨酸(Lys ;K)、甲硫氨酸(Met ;M)、苯丙氨酸(Phe ;F)、脯氨酸(Pro ;P)、丝氨酸(Ser ;S)、苏氨酸(Thr ;T)、色氨酸(Trp ;W)、酪氨酸(Tyr ;Y)、以及缬氨酸(Val ;V)。发明详细说明
本发明涉及一种CrylI毒素、编码该毒素的核苷酸序列，并且涉及用来控制鳞翅目害虫的该CrylI毒素的制造和使用。根据一个实施例，本发明提供了一种包含719个氨基酸并且具有与SEQ ID NO:1至少99%的一致性的CrylI毒素，其中相应于位置140的氨基酸是谷氨酸(E)，相应于位置184的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置233的氨基酸是天冬氨酸(D)，相应于位置329的氨基酸是异亮氨酸(I)，相应于位置377的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置393的氨基酸是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)，相应于位置549的氨基酸是亮氨酸(L)，并且相应于位置712的氨基酸是亮氨酸(L)或谷氨酰胺(Q)。本发明的另一个实施例是包含编码CrylI毒素的719个氨基酸的核苷酸序列并且具有与SEQ ID NO:1至少99%的一致性的一种核酸分子，其中在位置140处的氨基酸是谷氨酸(E)，在位置184处的氨基酸是苏氨酸(T)，在位置233处的氨基酸是天冬氨酸(D)，在位置329处的氨基酸是异亮氨酸(I )，在位置377处的氨基酸是苏氨酸(T)，在位置393处的氨基酸是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)，在位置549处的氨基酸是亮氨酸(L)，在位置712处的氨基酸是亮氨酸(L)或谷氨酰胺(Q)。在另一个实施例中，该核苷酸序列包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成:SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4。在又另一个实施例中，该核苷酸序列针对在植物中的表达而被密码子优化。在再又另一个实施例中，密码子优化的序列包括一个选自下组的序列，该组由以下各项组成:SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6。在另一个实施例中，CrylI毒素针对鳞翅目昆虫是有活性的，而针对鞘翅目昆虫是没有活性的。本发明的又另一个实施例是一种嵌合基因，该嵌合基因包括一种异源启动子序列，该异源启动子序列可操作地连接至一个编码所述CrylI毒素的核酸序列、或SEQ IDNO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、或SEQ ID NO:6中的任何一个序列。在又另一个实施例中，所述启动子是一种植物表达性启动子。在再又另一个实施例中，该植物表达性启动子选自下组，该组由以下各项组成:泛素、cmp、玉米TrpA、细菌噬菌体T3基因95’ UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、豌豆小亚基RuBP羧化酶、Ti质粒甘露碱合成酶、Ti质粒胭脂碱合成酶、牵牛花查尔酮异构酶、大豆富含甘氨酸蛋白1、马铃薯块茎特异蛋白、凝集素、CaMV35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。本发明的再又另一个实施例是一种重组载体，该重组载体包含编码所述CrylI毒素的核酸序列、或 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5、或 SEQ ID NO:6 中的任何一个序列。在另一个实施例中，该载体被进一步限定为质粒、粘粒、噬菌粒、人工染色体、噬菌体或病毒载体。在又另一个实施例中，该载体被包含在转基因非人类宿主细胞中。在再又另一个实施例中，该宿主细胞是一种转基因植物细胞。在进一步的又另一个实施例中，该转基因植物细胞是玉米、小麦、水稻、大豆、烟草、或棉花。在本发明的另一个实施例中，本发明的CrylI毒素是在一种高等生物(例如，一种植物)中表达的。在这种情况下，表达有效量的毒素的转基因植物保护这些植物自身免受害虫的影响。当昆虫开始以这种转基因植物为食时，它同样摄取这种表达的毒素。这将妨碍昆虫进一步咬食植物组织或者甚至可以伤害或杀死昆虫。本发明的一种核苷酸序列被插入到一种表达盒中，然后该表达盒被稳定地整合到植物的基因组中。在另一个实施例中，该核苷酸序列被包含在一种非致病性自我复制病毒中。根据本发明所转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于:玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒(pepper)、芹菜、南瓜(squash)、南瓜(pumpkin)、大麻、西葫芦、苹果、梨、媪梓、甜瓜、李子(plum)、楼桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、木瓜、芒果、香蕉、大豆、番U、高粱、甘鹿、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥属，以及木本植物，如针叶树以及落叶树。一旦一种所希望的核苷酸序列已经被转化到一种特定的植物种类中，使用传统的育种技术可以使其在这个种类中繁殖或将其转移到相同种类的其它品种中，特别包括商业品种。本发明的一种核苷酸序列表达于转基因植物中，由此引起相应的CrylI毒素在这些转基因植物中的生物合成。以这种方式，产生了对昆虫具有增强的抗性的转基因植物。为了它们在转基因植物中的表达，本发明的核苷酸序列可能需要修饰和优化。虽然在许多情况下，来自微生物的基因能够在植物中以高水平表达而无需修饰，在转基因植物中的低表达可能是由于具有在植物中并不优选的密码子的微生物核苷酸序列的缘故。在本领域中已知的是，所有生物都具有特定的密码子使用偏好，而且在本发明中描述的这些核苷酸序列的密码子可以被改变以符合植物偏好，同时维持由其编码的这些氨基酸。此外，在植物中高表达最好地由以下编码序列实现，这些编码序列具有至少大约35%、或至少大约45%、或至少大约50%、或至少大约60%的GC含量。由于存在着可能使信息不稳定的ATTTA基序、以及可以引起不适当的多聚 腺苷酸化的AATAAA基序，具有低GC含量的微生物核苷酸序列在植物中可能表达不良。虽然某些基因序列可以在单子叶植物和双子叶植物种类两者中充分表达，还可以对序列进行修饰以便解决单子叶植物或双子叶植物特定的密码子偏好以及GC含量偏好，因为这些偏好已经被证明是不同的(Murray et al.《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.) 17:477-498(1989))。另外，针对异常剪接位点的存在筛选这些核苷酸序列，这些异常剪接位点可能引起信息截短(message truncation)。使用熟知的定点诱变、PCR、以及合成基因的构建，使用描述于公开的专利申请EP0385962 (授予Monsanto)、EP0359472 (授予Lubrizol )、以及W093/07278 (授予Ciba-Geigy)中的方法，对在这些核苷酸序列之内所有需要做出的变化(如以上所说明的那些变化)做出改变。在本发明的一个实施例中，根据在美国专利号5，625，136 (通过引用结合在此)中所披露的程序来制造合成的基因。在这个程序中，使用了玉米偏爱密码子，即最频繁地编码玉米中的氨基酸的单一密码子。针对一种特定的氨基酸的玉米偏爱密码子可以源自，例如，来自玉米的已知基因序列。针对来自玉米植物的28个基因的玉米密码子使用发现于Murray et al.,《核酸研究》(Nucleic Acids Research) 17:477-498 (1989)中，其披露内容通过引用结合在此。本发明的确切示例性的用玉米产生的合成序列列出在SEQ ID NO:5和6中。以这种方式，可以针对在任何植物中的表达而将这些核苷酸序列优化。认识到的是该基因序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用合成的或部分优化的序列。为了有效的翻译起始，可能需要修饰与起始甲硫氨酸相邻的序列。例如，它们可以通过包含已知在植物中有效的序列而被修饰。Joshi已经提出了针对植物的适当共有序列(NARl5:6643-6653 (1987))，并且 Clonetech 提出了另一个共有翻译起始子(1993/1994 目录，210页)。这些共有序列适合与本发明的核苷酸序列一起使用。将这些序列结合至包含核苷酸序列的构建体中，达到ATG并且包括ATG (同时保持不修饰第二个氨基酸)，或者可替代地达到ATG后的GTC并且包括ATG后的GTC (具有修饰该转基因的第二个氨基酸的可能性)。本发明的新颖的cryll毒素编码序列，作为它们的天然序列抑或作为如上所述的优化的合成序列，可以可操作地与用于在植物中表达的多种启动子(包括组成型、诱导型、时序调节的、发育调节的、化学调节的、组织优选的以及组织特异性启动子)融合以制备重组DNA分子(即嵌合基因)。启动子的选择将依赖于表达的时间和空间需要而变化，并且还依赖于目标种类而变化。因此，本发明的核苷酸序列在叶、柄(stalk)或茎(stem)中，在穗中，在花序(例如穗状花序、圆锥花序、穗轴，等等)中，在根、和/或籽苗中的表达是优选的。然而在许多情况下，寻求针对一种以上类型的害虫的保护，并且因此在多种组织中的表达是令人希望的。虽然已经显示来自双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，理想的是选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中的表达，并且选择单子叶植物启动子用于在单子叶植物中的表达。然而，对所选择的启动子的起源并没有限制，只要它们在驱动核苷酸序列在所希望的细胞中的表达中是可操作的就足够了。在本发明中有 用的组成型启动子的实例包括CaMV35S和19S启动子(Fraley等人，美国专利号5，352，605，通过引用结合在此)。另外，一种启动子源自几种肌动蛋白基因的任何一种，这些肌动蛋白基因在大多数细胞类型中被表达。由McElroy等人在《分子遗传学与普通遗传学》(Mol.Gen.Genet.) 231:150-160(1991)中描述的启动子表达盒可以易于被修饰用于新颖的毒素基因的表达并且特别适合用于在单子叶植物宿主中使用。又另一个组成型启动子源自泛素，泛素是已知在许多细胞类型中积聚的另一种基因产物。已经从一些种类中克隆泛素启动子用于在转基因植物中使用，例如在向日葵(比奈(Binet)等人，1991.《植物科学》(Plant Science79:87-94))、玉米(克里斯坦森(Christensen)等人，1989.《植物分子生物学》(Plant Molec.Biol.12:619-632))、以及拟南芥属(诺里斯(Norris)等人1993.《植物分子生物学》(Plant Molec.Biol.) 21:895-906)中使用。已经在转基因单子叶植物系统中产生玉米泛素启动子，并且它的序列以及构建用于单子叶植物转化的载体披露于专利公开EP0342926中。泛素启动子适合用于新颖的毒素基因在转基因植物(尤其是单子叶植物)中的表达。对于在植物(特别是玉米)中表达本发明的新颖的cryll毒素编码序列是有用的组织特异性或组织优先的启动子是那些在根、髓、叶或花粉中直接表达的启动子。此类启动子披露于W093/07278中，通过引用以其全文结合在此。在本发明中有用的其他组织特异性启动子包括棉花rubisco (二磷酸核酮糖羧化酶)启动子，披露于美国专利号6，040，504中；水稻蔗糖合成酶启动子，披露于美国专利号5，604，121 ;以及夜香树黄叶卷曲病毒启动子，披露于W001/73087中，所有专利通过引用而结合。对于指导新颖毒素基因在植物中的表达有用的化学诱导型启动子披露于美国专利号5，614，395中(通过引用以其全文结合在此)。本发明的核苷酸序列也可以在被化学调节的启动子的调节下表达。这使得CrylI毒素能够仅当用诱导化学品对作物植物进行处理时被合成。用于基因表达的化学诱导的优选技术详述于公开申请EP0332104 (授予Ciba-Geigy)以及美国专利号5，614，395中。用于化学诱导的一种优选启动子是烟草PR-1a启动子。另一类在本发明中有用的启动子是创伤可诱导的启动子。已经说明了数量众多的在创伤部位并且也在植物病原体感染的部位表达的启动子。理想的是，这样的启动子应当在感染部位仅仅是局部活性的，并且以这种方式这些杀虫毒素仅仅在需要合成这些杀虫毒素的细胞中积聚以杀死侵入的害虫。优选的这种启动子包括由斯坦福(Stanford)等人《分子遗传学与普通遗传学》(Mol.Gen.Genet.215:200-208(1989))、徐(Xu)等人《植物分子生物学》(Plant Molec.Biol.) 22:573-588(1993)、洛格曼(Logemann)等人《植物细胞》(Plant Celll: 151-158 (1989))、罗尔迈尔和莱勒(Rohrmeier & Lehle)，《植物分子生物学》(Plant Molec.Biol.22:783-792(1993))、Firek等人《植物分子生物学》(Plant Molec.Biol.22:129-142 (1993))、以及华纳(Warner)等人《植物杂志》(Plant J.)3:191-201(1993)所说明的启动子。在本发明中有用的引起组织特异性表达模式的启动子包括绿色组织特异性的、根特异性的、茎特异性的、以及花特异性的启动子。适合用于在绿色组织中表达的启动子包括调节涉及光合作用的基因的许多启动子，并且这些中的许多已经从单子叶植物和双子叶植物两者克隆出来。一种这样的启动子是来自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的玉米PEPC启动子(赫兹佩思和格露拉(Hudspeth & Grula),《植物分子生物学》(Plant Molec.Biol.)12:579-589(1989))。另一 种用于根特异性表达的启动子是由de FramondCFEBS290:103-106(1991) ;EP0452269)描述的启动子。优选的茎特异性启动子是在美国专利号5，625，136中描述的并且驱动玉米trpA基因的表达的启动子。本发明的另外实施例是以一种创伤可诱导的方式或病原体感染可诱导的方式表达核苷酸序列的转基因植物。除了选择一种适合的启动子之外，用于在植物中的杀虫毒素的表达的构建体还需要一种适当的、附接在异源核苷酸序列下游的转录终止子。若干这样的终止子是可获得的并且在本领域是已知的(例如来自CaMV的tml，来自rbcS的E9)。任何一种已知在植物中起作用的可供使用的终止子均可以在本发明的背景下使用。可以将数量众多的其他序列结合在本发明中所说明的表达盒中。这些序列包括已经显示出增强表达的序列，如内含子序列(例如,来自Adhl和bronzel)以及病毒的前导序列(例如，来自TMV、MCMV,以及AMV)。针对在植物中的不同细胞定位的本发明的核苷酸序列的靶向表达可能是更优选的。在某些情况下，在胞质溶胶中的定位可能是令人希望的，而在其他情况下，在某个亚细胞器中的定位可能是优选的。转基因编码的酶类的亚细胞定位是使用本领域熟知的技术进行的。典型地，处理编码来自一种已知的靶向细胞器的基因产物的目标肽的DNA并使其融合在该核苷酸序列的上游。针对叶绿体的许多这样的靶序列是已知的并且已经证明了它们在异源构建体中的功能。还将本发明的核苷酸的表达靶向至宿主细胞的内质网或液泡。实现这个目的的技术在本领域是熟知的。对于那些在植物转化领域的普通技术人员而言，可用于植物转化的众多转化载体是已知的，并且本发明的核酸分子可以与任何这样的载体结合使用。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标植物种类。对于某些目标种类，可以优选不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中常规使用的选择标记包括nptll基因，它赋予了对卡那霉素及相关抗生素的抗性(梅新和比埃拉(Messing & Vierra.), 1982.《基因》(Gene)19:259-268 ；以及贝文(Bevan)等人，1983.《自然》(Nature) 304:184-187) ;bar 基因，它赋予了对于除草剂草丁膦的抗性(怀特(White)等人，1990.《核酸研究》(Nucl.AcidsRes) 18:1062 ；以及斯宾塞(Spencer)等人，1990.《理论与应用遗传学》(Theor.Appl.Genet) 79:625-631) ；hph基因，它赋予了对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger和迪格尔曼(Diggelmann)，《分子细胞生物学》(Mol Cell Biol) 4:2929-2931);以及 dhfr 基因，它赋予了对于甲氨蝶呤的抗性(Bouixniis等人，《欧洲分子生物学组织期刊》(EMBO J.)2(7): 1099-1104(1 983) )；EPSPS基因，它赋予了对草甘膦的抗性(美国专利号4，940，935和5，188，642)；以及甘露糖-6-磷酸异构酶基因，它提供了代谢甘露糖的能力(美国专利号5，767，378和5，994，629)。然而，选择标记的选择对于本发明并不是至关重要的。在另一个实施例中，本发明的一种核苷酸序列被直接转化进入质体基因组中。质体转化的一个主要优点在于质体通常能够表达细菌基因而无需重要修饰，而且质体能够在一种单一启动子的控制下表达多个开放阅读框。在美国专利号5，451，513、5，545，817、以及5，545，818、在PCT申请号W095/16783、并且在麦克布莱德(McBride)等人(1994)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91, 7301-7305)中广泛说明了质体转化技术。叶绿体转化的基础技术涉及，例如，使用生物射弹(biolistics)或原生质体转化(例如,氯化钙或PEG介导的转化)将位于一种选择标记侧翼的I至1.5kb的克隆的质体DNA区(被称为靶向序列)连同所感兴趣的基因一起引入到一种适合的靶组织中。这些靶向序列促进了与质体基因组的同源重组，并且因而允许置换或修饰原质体(Plastome)的特定区域。最初，将叶绿体16S rRNA和rpsl2基因(赋予了针对大观霉素和/或链霉素的抗性)的点突变用作用于转化的选择标记(斯瓦布(Svab, Z.)、海杜凯维奇(Hajdukiewicz, P.)、以及马利加(Maliga, P.) (1990)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)87, 8526-8530);斯托布(Staub，J.M.)、以及马利加(Maliga，P.) (1992)《植物细胞》(Plant Cell )4，39—45)。在这些标记之间的克隆位点的存在允许建立一种用于引入外源基因的质体靶向载体(斯托布(Staub，J.M.)、以及马利加(Maliga，P.) (1993)《欧洲分子生物学组织期刊》(EMBO J.)12，601-606)。通过用一种显性选择标记(细菌aadA基因，它编码了大观霉素去毒酶-氨基糖苷_3’ -腺苷酰转移酶)置换这些隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因而获得转化频率的显著增加(斯瓦布(Svab，Z.)、以及马利加(Maliga，P.) (1993)《美国国家科学院院干lj》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)90, 913-917)。之前,这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻(Chlamydomonas代;[111^1(11:;[；0这种绿藻的质体基因组的高频率转化(戈尔德施密特-克莱蒙特(Goldschmidt-Clermont, M.)(1991)《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)19:4083-4089)。用于质体转化的其他选择标记是本领域已知的，并且包括在本发明的范围之内。典型地，转化之后需要大致15-20个细胞分裂循环以便达到一种同质状态。质体表达(其中多种基因通过同源重组被插入到在每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的庞大的拷贝数目的优点，以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10%的表达水平。在一个优选的实施例中，将本发明的一种核苷酸序列插入至一种质体靶向的载体中并且转化至一种所希望的植物宿主的质体基因组中。获得了含有本发明的一种核苷酸序列的对于质体基因组同型的植物，并且这些植物优选地能够高表达该核苷酸序列。本发明的又另一个实施例是从以上转基因植物衍生的、并且包含CrylI毒素的生物样品。在又另一个实施例中，该杀虫蛋白保护该生物样品免于昆虫侵染。在再又另一个实施例中，该生物样品选自下组，该组由以下各项组成:面粉、粗粉、油、以及淀粉、或一种从它们衍生的产品。本发明的另一个实施例是一种为农民提供了控制鳞翅目害虫的手段的方法，该方法包括向农民供应或出售植物材料，该植物材料包括能够表达如上所述的CrylI毒素的一种核酸分子。本发明的另一个实施例是产生本发明的CrylI毒素的方法，该方法包括以下步骤:(a)用一种包含编码该CrylI毒素的核苷酸序列的重组核酸分子转化一种非人类宿主细胞；并且(b)在步骤(a)的宿主细胞表达该重组核酸分子的条件下培养这种宿主细胞，由此产生CrylI毒素。在另一个实施例中，该非人类宿主细胞是一种植物细胞。在另一个实施例中，该植物细胞是一种玉米细胞。在另一个实施例中，该重组核酸分子针对在植物中的表达而被密码子优化。在另一个实施例中，该重组核酸分子包括选自下组的序列，该组由以下各项组成:SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、以及 SEQ ID N0:6。在另一个实施例中，该重组核酸分子进一步包括一种启动子序列，该启动子序列可操作地连接至所述核苷酸序列以允许由该 宿主细胞进行的该核苷酸序列的表达以及该CrylI毒素的产生。在另一个实施例中，转化是通过土壤杆菌介导的转化、电穿孔、或微粒轰击而进行的。本发明的另一个实施例是减少在转基因植物中由鳞翅目昆虫和鞘翅目昆虫引起的虫害的一种方法，该方法包括:种植包含一个第一转基因和一个第二转基因的转基因植物种子，其中该第一转基因引起一种CrylI毒素的表达并且其中该第二转基因引起一种来自苏云金芽孢杆菌的毒素的表达；由此减少由鳞翅目昆虫和鞘翅目昆虫引起的对从该转基因植物种子生长的转基因植物的损害。在另一个实施例中，该CrylI毒素包含719个氨基酸并且具有与SEQ ID NO:1至少99%的一致性，其中相应于位置140的氨基酸是谷氨酸(E)，相应于位置184的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置233的氨基酸是天冬氨酸(D)，相应于位置329的氨基酸是异亮氨酸(I)，相应于位置377的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置393的氨基酸是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)，相应于位置549的氨基酸是亮氨酸(L)，相应于位置712的氨基酸是亮氨酸(L)或谷氨酰胺(Q)。在另一个实施例中，该第一转基因包括一种选自下组的核苷序列，该组由以下各项组成:SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5以及SEQ ID N0:6。在另一个实施例中，来自苏云金芽孢杆菌的毒素是Cry毒素或VIP毒素。在另一个实施例中，该Cry毒素是一种Cry3毒素。在另一个实施例中，该Cry3毒素是一种修饰的Cry3A毒素。在另一个实施例中，该转基因植物是玉米、小麦、水稻、大豆、烟草、或棉花。在另一个实施例中，该转基因植物是玉米。本发明的CrylI毒素可以与苏云金芽孢杆菌Cry毒素或其他杀虫成分结合使用以增加害虫的目标范围。此外，本发明的CrylI毒素与具有不同性质的Bt Cry毒素或其他杀虫成分的结合使用对于预防和/或处理昆虫抗性具有特殊效用。其他的杀虫成分包括蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸型两者)、凝集素、α -淀粉酶、过氧化物酶以及胆固醇氧化酶。营养期杀虫蛋白，如ViplAa和Vip2Aa或Vip3在本发明中也是有用的。可以通过将一种植物遗传工程化以包含并表达所有的必需基因来实现一种以上的杀虫成分在同一个转基因植物中的这种共表达。可替代地，可以将一种植物(亲本I)遗传工程化，用于本发明的基因的表达。可以将一种第二植物(亲本2)遗传工程化，用于一种补充性昆虫控制成分的表达。通过将亲本I与亲本2杂交，获得了表达被引入至亲本I和亲本2中的所有基因的子代植物。还可以将本发明的转基因植物或转基因种子用杀虫活性成分处理。其中本发明的杀虫活性成分以及转基因植物或转基因种子针对同一种目标昆虫是具有活性的，该组合
(i)在用于增强本发明的一种CrylI毒素针对目标昆虫的活性的方法中以及(ii)在用于通过提供针对该目标昆虫的一种第二作用机制而防止对本发明的CrylI毒素产生抗性的一种方法中是有用的。因此，本发明提供了一种增强活性的方法，这种活性对抗或防止在一种目标昆虫(例如，玉米根虫)中产生抗性，该方法包括将一种杀虫性种子包衣(如在美国专利号5，849，320和5，876，739中所述的，通过引用结合在此)施用至包含本发明的一种或多种CrylI毒素的一种转基因种子上。甚至在杀虫活性成分针对不同的昆虫或其他害虫是有活性的情况下，该杀虫活性成分对于扩大害虫控制的范围是有用的。与单独的转基因植物或种子相比，例如通过将针对鳞翅目昆虫、对螨、对线虫等等具有活性的杀虫活性成分(针对鞘翅目昆虫具有活性)施用至本发明的转基因植物或种子而产生的转基因植物或包衣的转基因种子控制较广谱的作物害虫。因此在一个实施例中，本发明包括通过提供本发明的转基因植物或转基因种子并且将活性成分施用至该转基因植物或种子而控制作物害虫的方法。这样的可以施用至如上所述的本发明的转基因植物和/或转基因种子的活性成分包括但不限于:(1)乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂，例如氨基甲酸酯类，如棉铃威、涕灭威、涕灭砜威、除害威、灭害威、噁虫威、丙硫克百威、合杀威、畜虫威、丁酮威、丁酮砜威、甲萘威、呋喃丹、丁硫克百威、除线威、敌蝇威、乙硫苯威、仲丁威、苯硫威、伐虫脒、呋线威、异丙威、威百亩、灭虫威、灭多威、速灭威、杀线威、抗蚜威、猛杀威、残杀威、硫双威、久效威、三甲威、XMC以及灭杀威；或有机磷酸酯，例如乙酰甲胺磷、甲基吡噁磷、谷硫磷(_甲基、-乙基)、溴硫磷-乙基、溴苯烯磷(_甲基)、脱甲基丁卩密唳磷(butathiofos)、硫线磷、三硫磷、氯氧磷、氯芬磷、氯甲磷、毒死蜱(_甲基/_乙基)、蝇毒磷、苯腈磷、杀螟腈、氯芬磷、内吸磷-5-甲基、内吸磷-5-甲基砜、氯亚磷、二嗪磷、除线磷、敌敌畏/DDVP、百治磷、乐果、甲基毒虫畏、蔬果磷、乙拌磷(disulphoton)、EPN、乙硫磷、灭线磷、乙嘧硫磷、氨磺磷、苯线磷、杀螟硫磷、丰索磷、倍硫磷、批氟硫磷、地虫硫磷、安果、丁苯硫磷、噻唑硫磷、庚烯磷、碘硫磷、异稻瘟净、氯唑磷、异柳磷、异丙基O-水杨酸酯、异噁唑磷、马拉硫磷、灭蚜磷、虫螨畏、甲胺磷、杀扑磷、速灭磷、久效磷、二溴磷、氧乐果、砜吸磷、对硫磷(_甲基/_乙基)、稻丰散、甲拌磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷 、磷胺、磷虫威、辛硫磷、嘧啶磷(_甲基/_乙基)、丙溴磷、丙虫磷、胺丙畏、丙硫磷、发果、吡唑硫磷、哒嗪硫磷、哒硫磷、喹硫磷、硫线磷、治螟磷(s u IP h ο t e P )、硫丙磷、丁基卩密唳磷、双硫磷、特丁硫磷、杀虫畏、甲基乙拌磷、三唑磷、敌百虫、姆灭磷、以及imicyafos。(2)GABA-门控氯离子通道拮抗剂,例如有机氯,例如毒杀芬、氯丹、硫丹、Y-HCH、HCH、七氯、林旦以及甲氧氯；或fiproles (苯基卩比唑),例如乙酰虫腈、乙虫腈、氟虫腈、卩比嗪氟虫腈(pyrafluprole)、卩比唳氟虫腈(pyriprole)、甲烯氟虫腈(vaniIiprole)。(3)钠通道调节剂/电压依赖性钠通道阻滞剂，例如拟除虫菊酯，如氟丙菊酯、烯丙菊酯(d-顺式-反式、d-反式)、β -氟氯氰菊酯、联苯菊酯、生物烯丙菊酯、生物烯丙菊酯-S-环戍基异构体、节呋烯菊酯(bioethanomethrin)、生物氯菊酯、除虫菊酯、二氯炔戍菊酯(chlovaporthrin)JiS -氯氰菊酯、顺式-节呋菊酯、顺式-氯菊酯、功夫菊酯(clocythrin)、乙氰菊酯、氟氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、氯氰菊酯(α-、β-、θ-、ξ-)、苯醚氰菊酯、溴氰菊酯、烯炔菊酯(IR异构体)、高氰戊菊酯、醚菊酯、五氟苯菊酯、甲氰菊酯、吡氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氟菊酯、氟氰菊酯、三氟醚菊酯、氟氯苯菊酯、氟胺氰菊酯、扫螨宝、Y-三氯氟氰菊酯、炔咪菊酯、噻恩菊酯、λ-三氯氟氰菊酯、甲氧苄氟菊酯、氯菊酯(顺式_、反式-)、苯醚菊酯(IR-反式异构体)、右旋炔丙菊酯、丙氟菊酯、丙苯烃菊酯(protrifenbute)、pyresmethrin、节呋菊酯、RU15525、氟娃菊酯、τ -氟胺氰菊酯、七氟菊酯、环戊烯丙菊酯、胺菊酯(IR异构体)、四溴菊酯、四氟菊酯、ΖΧΙ8901、除虫菊酯(除虫菊)、eflusilanat ；DDT ;或甲氧氯。(4)烟碱能乙酰胆碱受体激动剂/拮抗剂，例如氯化烟酰类(Chloronicotinyls),如唳虫脒、噻虫胺、呋虫胺、批虫啉、氯噻啉、烯唳虫胺、噻虫醒、噻虫嗪、AKD-1022、烟碱、杀虫磺、杀螟丹、杀虫双、以及杀虫环(thiocylam)。(5)变构乙酰胆喊受体调节剂(激动剂)，例如多杀霉素(spinosyns),如多杀菌素以及乙基多杀菌素。(6)氯离子通道激活剂，例如mectins/大环内酯，如阿维菌素、埃玛菌素、埃玛菌素苯甲酸盐、伊维菌素、雷皮菌素、以及弥拜菌素；或保幼激素类似物，例如烯虫乙酯、烯虫炔酯、烯虫酯、保幼醚、烯虫硫酯、苯氧威、卩比丙醚(pyriproxifen)、以及苯虫醚。(7)具有未知的或非特异性的作用机制的活性成分，例如熏蒸剂，例如甲基溴、氯化苦以及硫酰氟(sulphurylfluoride);选择性拒食素,例如冰晶石、卩比嗪酮、pyrifIuquinazon以及氟唳虫酰胺；或螨生长抑制剂，例如四螨嗪、噻螨酮、乙螨唑。(8)氧化磷酸化抑制剂、ATP干扰剂，例如杀螨隆；有机锡化合物，例如三唑锡、三环锡以及苯丁锡；或克螨特、四氯杀螨砜。(9)破坏H质子梯度的氧化磷酸化去耦合剂，例如溴虫腈、乐杀螨、敌螨通、敌螨普以及DN0C。(10)昆虫肠膜的微生物干扰剂，例如苏云金芽孢杆菌菌株。(11)甲壳质生物合成抑制剂，例如苯甲酰脲，例如双三氟虫脲(bistrifluoron)、定虫隆、除虫脲、批虫隆、氟环脲、氟虫脲、氟铃脲、氯芬新、双苯氟脲、多氟脲、氟幼脲、氟苯脲或杀铃脲。(12)噻嗪酮。(13)蜕皮干扰剂，例如环丙氨嗪。(14)蜕皮激素激动剂/干扰剂，例如双酰肼，例如环虫酰肼、氯虫酰肼、甲氧虫酰肼、虫酰肼、以及呋喃虫酰肼(JS118);或印楝素。(15)章鱼胺能激动剂，例如双甲脒；
(16)位点III电子传递抑制剂/位点II电子传递抑制剂，例如氟蚁腙；灭螨醌；嘧螨酯；或丁氟螨酯以及腈吡螨酯。(17)电子传递抑制剂，例如来自METI杀螨剂的组的位点I电子传递抑制剂，例如喹螨醚、唑螨酯、嘧螨醚、哒螨灵、吡螨胺、唑虫酰胺、以及鱼藤酮；或电压依赖性钠通道阻滞剂，例如茚虫威以及氰氟虫腙。(18)脂肪酸生物合成抑制剂，例如季酮酸衍生物，例如螺螨 酯以及螺甲螨酯；或特特拉姆酸衍生物，例如螺虫乙酯。(19)具有未知作用机制的神经元抑制剂，例如联苯肼酯。(20)利阿诺定受体效应剂，例如二酰胺，如氟虫双酰胺、(R)-, (S)-3-氯-N.sup.1-{2-甲基 _4-[1，2, 2, 2-四氟 _1_( 二氟甲基)-乙基]苯基}-N.sup.2-(1-甲基-2-甲基磺酰基乙基)酞酰胺、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰虫酰胺(Cyazypyr )。(21)具有未知作用机制的另外的活性成分,例如磺胺螨酯、异噻虫唑(benclothiaz)、苯螨特、溴螨酯、噻嗪酮、灭螨猛、杀虫脒、乙酯杀螨醇、clothiazoben、cycloprene、开乐散、地昔尼尔、fenoxacrim、芳氟胺(fentrifanil)、氟螨噻、卩密虫胺、flutenzin、红铃虫性诱剂、日本金龟子性引诱剂、恶虫酮、石油、油酸钾、三氟甲吡醚、氟虫胺、杀螨好、苯螨噻、或增效炔醚；或以下已知的活性化合物:4-{[(6_溴吡啶-3-基)甲基](2-氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)_酮(从TO2007/115644已知)、4_ {[ (6-氟吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)_ 酮(从 W02007/115644 已知)、4-{[(2_ 氯-1，3-噻唑-5-基)甲基](2-氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)_酮(从W02007/115644已知)、4_{[(6_氯吡啶-3-基)甲基](2-氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)_酮(从W02007/115644已知)、4_ {[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)_酮(从W02007/115644已知)、4-{[(6_氯-5-氟吡啶-3-基)甲基](甲基)氨基}呋喃-2(5H)_酮(从已知W02007/115643)、4-{[(5，6-二氯吡啶-3-基)甲基](2-氟乙基)氨基}呋喃_2(5H)_酮(从TO2007/115646已知)、4_ {[ (6-氯-5-氟吡啶-3-基)甲基](环丙基)氨基}呋喃-2(5H)_酮(从TO2007/115643已知)、4_ {[ (6-氯吡啶-3-基)甲基](环丙基)氨基}呋喃-2(5H)_酮(从EP-A-0539588已知)、4_{[ (6-氯吡啶-3-基)甲基](甲基)氨基}呋喃-2(5H)_酮(从EP-A-0539588已知)、[(6-氯吡啶-3-基)甲基](甲基)氧_.入..8即.4-硫亚基-氰胺(从冊2007/149134已知)、[1-(6-氯吡啶-3-基)乙基](甲基)氧X..Sup.4-硫亚基-氰胺(从W02007/149134已知)以及它的非对映异构体(A)和(B)(同样从W02007/149134已知)、[(6-三氟甲基吡啶-3-基)甲基](甲基)氧_.入..sup.4-硫亚基-氰胺(从TO2007/095229已知)、或[1_ (6-三氟甲基吡啶-3-基)乙基](甲基)氧-.λ..sup.4-硫亚基-氰胺(从W02007/149134已知)以及它的非对映异构体(C)和(D)，称为氟啶虫胺腈(同样从W02007/149134已知)。

实例本发明的实施例可以通过引用以下实例而被更好地理解。前述内容以及本发明实施例的以下说明和不同实施例不是旨在限制权利要求书，而是对其具有说明性。因此，将理解的是权利要求书不旨在限制这些实例的具体细节。将被本领域的技术人员理解的是，可以在不偏离本披露的精神和范围的情况下实施本发明的其他实施例，本披露的范围是由所附权利要求书限定。实例1:芽孢杆菌DNA的分离将总DNA从苏云金芽孢杆菌菌株CGB316和CGB323进行分离。每个菌株的培养物在25° C在L-肉汤中、伴随在旋转摇床中150rpm的振荡过夜生长。将2ml培养物在IOK下离心，并且再悬浮于 700 μ 1:8% 蔗糖、IOOmM tris (pH8.0)UOmM EDTA、50mM NaCl 以及2mg/ml溶菌酶中。将再悬浮液在37° C孵育30分钟。将该溶液制成50 μ g/ml蛋白酶K，并且将20%SDS添加至0.2%终浓度并且在50° C孵育，直到该溶液变得非常粘稠。将等体积的苯酚/氯仿添加至溶液中，进行涡旋并且然后在10K下离心以分离多个相。然后将水相与具有150 μ g/ml溴化乙锭的lg/mlCsCl进行混合。将混合物放置在33ml NalgeneUltraLok管中，用lg/mlCsCl加满,进行封盖并且在一个Beckman Ti50超速离心转子中在45，OOOrpm离心持续16个小时。将DNA带用UV光源可视化，并且用一个使用16号针头的注射器移除该带。通过异戊醇萃取将溴化乙锭去除。将DNA用2体积的100%乙醇进行沉淀，并且在IOK离心，然后将DNA用70%乙醇洗涤，离心，并且将DNA沉淀在室温下干燥。将干燥的沉淀再悬浮于200 μ I的IOmM tris (pH8.0)、ImM EDTA中。将来自CGB316 和 CGB323 的 15 μ g 的 DNA 各自用 0.1 单位 Sau3A/l μ g DNA 在37° C进行消化。在添加限制性内切酶3、5和10分钟之后将5 μ g样品移除，并且添加500mMEDTA以制成IOmM EDTA的终浓度并且放置在冰上。利用tris-硼酸盐-EDTA(TBE ;萨姆布鲁克(Sambrook)等人)缓冲液将样品负载在0.8%琼脂糖凝胶上，并且在IBI型号MPH凝胶电泳系统中在25伏特进行电泳过夜。将用HindIII消化的λ DNA作为分子量标记进行电泳。将在6-9kb范围内的DNA片段从凝胶切出。将这些凝胶切片放置在Nanotrap电洗脱讲(Nanotrap electroelution trap)中，并且利用由供应商描述的具有缓冲系统和电流的ISCO小蓝箱(ISC0 Little Blue Tank)，由此将DNA从琼脂糖凝胶电洗脱出来。通过添加1/10体积3M乙酸钠(pH4.8)、2.5体积100%乙醇使从琼脂糖分离的DNA沉淀并且离心。将DNA用70%乙醇洗涤并且离心。将干燥的沉淀再悬浮于20μ I的IOmM tris (pH8.0)、lmMEDTA 中。将再悬浮的DNA连接至pUC19。使用4 μ I的6_9kb DNA溶液、用BamHI消化的并且用小牛碱性磷酸酶处理的I μ I的IOOng/μ I的pUC19、l μ I IOX连接缓冲液、3 μ I水、以及1μ I包括3个单位的Τ4连接酶来完成连接。使连接反应在15° C孵育过夜并且然后转化到大肠杆菌(E.coli)DH5a感受态细胞中，该转化如下完成:(a)将连接混合物与200 μ I细胞混合并且然后放置在冰上持续1-2小时；(b)在42° C加热持续90秒；(c)与200 μ I的SOC培养基(萨姆布鲁克等人)混合，并且在37° C孵育持续45分钟；并且(d)将该溶液平板接种在具有100 μ g/ml氨苄青 霉素的L-琼脂平板(萨姆布鲁克等人)上。将平板在37° C孵育过夜。如萨姆布鲁克等人所述进行菌落杂交。简言之，每个平板具有一个放置在其上并且然后被揭下的85mm Nitroplus2000过滤圆片(filter circle)。在揭下之后将平板在37° C孵育直到菌落再次可见的。将在它们的上面具有菌落的过滤圆片在沃特曼(Whatman)纸上用 10%SDS、继之用 0.5NNa0H-l.5M NaCl，并且然后用 1.5M NaCl-0.5M tris(pH7.4)(各自持续3分钟)饱和而进行处理。然后将过滤圆片用2X SSC饱和，并且通过使用在0.2m焦耳的Stratalinker (Stratagene)的UV交联而将DNA固定至过滤圆片上。对于每个菌株做了总计6个平板，每个平板具有100-200个菌落。过滤圆片的预杂交和杂交是在 IOX Denhardts 溶液、150 μ g/ml 剪切的鲑精 DNA、l%SDS、50mM 磷酸钠 pH (7.0)、5mMEDTA、6X SSC,0.05%焦磷酸钠中进行的。用在50ml体积中100万cpm/ml的32P_dCTP标记的探针，预杂交是在65° C持续4小时，并且杂交是在65° C持续18小时。使用BRL随机引物标记系统来制备放射标记的DNA探针,并且使用Nick柱(Pharmacia)去除未结合的计数。用PCR生成的cryIB放射性标记的片段来探测过滤圆片，该片段跨越了 crylB基因的区域461-1366bp (SEQ ID N0:7)。将探针在添加至杂交溶液之前煮沸5分钟。将过滤圆片在65° C，在50ml的2X SSC、0.5%SDS中洗涤两次，持续20分钟。在-80° C使过滤圆片暴露于具有Dupont Cronex Lightning Plus增感屏的Kodak X-Omat AR X-射线膜。鉴定阳性菌落，然后挑取阳性菌落并且在具有100 μ g/ml氨苄青霉素的L-琼脂上划线。使用在分子克隆(萨姆布鲁克(Sambrook)等人)中描述的碱性小量制备方法将质粒DNA进行分离。将含有5618-crylIa (SEQ ID NO:2)的克隆pCIB5618用Sacl/Bbul消化，并且将含有5621-crylIa (SEQ ID NO:4)的 pCIB5621 用 Smal/Bbul 消化。然后使用 TBE 缓冲系统各自负载到l%Seaplaque琼脂糖凝胶上，并且在25伏特下进行电泳过夜。将每个克隆的7kbDNA片段切出。如上所述在20μ I的总体积中，使用5μ I的熔化的(65° C)琼脂糖片段、处于IOng/ μ I的4 μ I的ΡΗΤ3101 (ρΗΤ3101是Bt/E.coli (苏云金芽孢杆菌/大肠杆菌)穿梭载体，包括PUC18、Bt复制子以及用于在Bt中选择的红霉素基因[勒卡代(Lecadet)等人1992])进行连接；用Sacl/Bbul或Smal/Bbul切割。如前所述转化大肠杆菌(E.coli)。然后将质粒DNA分离，用适当的限制性内切酶消化，并且在琼脂糖-TBE凝胶上进行电泳以证实正确基因的存在。实例2:表达载体的构建将寡核苷酸引物制成为跨越crylAc启动子的启动子区域(SEQ ID NO:8 ；GenBank登录号J01554)。SEQ ID N0:9是跨越SEQ ID NO:8的核苷酸I至20的引物，并且SEQ IDN0:10是跨越SEQ ID N0:8的核苷酸179-188的引物。限制酶切位点被结合到引物中，这些引物具有在正向引物的5’端的SfiI位点、以及在反向引物的3’端的PmeI位点。通过使用所述引物的PCR而产生205bp片段。将100-250ng的模板DNA以及在0.5μ M的各个引物添加至0.5ml GeneAmp反应管,该反应管含有如在GeneAmp盒(Perkin Emler Cetus)中所描述的50 μ I的PCR反应混合物。将AmpliTaq聚合酶(2.5单位；Perkin Emler Cetus)添加至各个管中。用GeneAmp PCR系统9600 (Perkin Elmer Cetus)来完成扩增,该系统使用步骤-循环(St印-Cycle)程序，该程序设定为在94° C变性持续45秒，在45° C退火持续45秒，并且在72° C延伸持续I分钟，随后为每个循环4秒延伸持续共计35个循环。扩增之后，将PCR反应混合物通过如由萨姆布鲁克等人所述的琼脂糖凝胶电泳进行分析。将PCR产物在l%Seaplaque (FMC生物产品)琼脂糖-TBE凝胶上进行电泳。将DNA片段切出，并且如由供应商所描述使用ISCO小蓝箱(ISC0 Little Blue Tank)(Lincoln,NE)进行电洗脱。将样品在 4° C进行乙醇沉淀过夜，用过量的70%乙醇进行洗涤，并且再悬浮于 IOmM Tris (pH8.0)、lmM EDTA 中。如由供应商所描述的，将分离的DNA片段用限制性内切酶SfiI和PmeI消化。将消化产物连接到用同样的限制性内切酶消化的质粒PCIB5614中。含有crylAc启动子的PCIB5614 被指定为 pCIB5634。通过用DraI(该DraI切割ATG起始密码子的120bp上游以及TAG终止密码子的下游以产生具有平头末端的3.8kb片段)消化，将crylla样编码序列从pCIB5618和pCIB5621分离。将此片段连接到用PmeI切割的pCIB5634中。如萨姆布鲁克等人所述将这些转化到DH5 α大肠杆菌细胞中。将菌落平板接种在加有100 μ g/ml氨苄青霉素的L琼脂平板上，37° C过夜。通过晶体包含体的存在鉴定阳性菌落。通过将5618-crylIa基因插入pCIB5634中而产生的质粒被指定为PCIB7950，并且通过将5621-crylIa基因插入pCIB5634中而产生的质粒被指定为PCIB7951。实例3:具有新颖基因的苏云金芽孢杆菌的转化用于转化的宿主是无晶体衍生物CGB324。使用的方法是舒尔特(Schurter)等人的方法并且描述于下文。用HD73-102的孢子接种IOml的L-肉汤，并且在25。C在旋转摇床上在IOOrpm孵育过夜。将过夜培养物在L-肉汤中稀释50倍，并且在30° C在旋转摇床上在250rpm孵育，直到培养物达到0.2的OD55(l。通过离心进行收获细胞，并且将其再悬浮于1/40体积的冰冷的电穿孔缓冲液(400mM蔗糖、ImM MgCl、7mM磷酸盐缓冲液(pH6.0),20%甘油)中。重复进行离心，并且将细胞如上所述的进行再悬浮。将400μ1的细胞添加至具有0.4cm电极间隙的Genepulser中，添加质粒DNA并且维持在4° C持续10分钟。通过使用BioRad Gen印ulser转染仪，将该溶液用25 μ Fad和1300伏特的电容器进行电穿孔。在4° C孵育另一个10分钟之后，将电穿孔溶液用1.6ml L-肉汤稀释，并且在30° C在250rpm的旋转摇床上孵育4小时。将培养物平板接种在加有25 μ g/ml红霉素的T3琼月旨(3g胰蛋白胨、2g胰蛋白示、1.5g酵母提取物、0.05g MgCl2,50mM磷酸钠pH6.8)上，并且在30° C孵育24-36小时以便使菌落可视化。将单菌落划线至加有红霉素的T3平板上，并且生长至芽孢形成。用显微镜鉴定产生晶体的菌落。实例4:抗科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)的crylla样基因的生物测定。在Gelman50mm培养皿中进行CPB测定，该培养皿具有一个Gemen47mm滤纸圆片，300 μ I的蒸馏水已经添加至该滤纸圆片上。将大肠杆菌培养物以1:1、1:2、或1:4稀释于
0.05%Triton X-100中，并且将2.7cm茄子叶穿孔产物浸泡在溶液中。允许这些物质在具有滤纸的培养皿中干燥。然后将五个一龄CPB幼虫放置在每个培养皿中并且将盖子放置在顶上；每个浓度测定20个幼虫。将培养皿放置在72° F的培养箱中持续3天，该培养箱具有14:10 (小时)光暗周期。然后记录在每个杯中的活的幼虫的数目。结果不于表I中。不像许多已知的CrylIa毒素,5618-CrylIa和5621-CrylIa毒素针对马铃薯甲虫(CPB)是没有活性的，指示氨基酸差异与功能差异有关。实例5:小菜蛾(Plutella xyostella)生物测定通过使过夜生长的大肠杆菌培养物(包含cryll样内毒素)的等分部分与熔化的人工小菜蛾(P.xyostella)饮食(比弗(Biever)和博尔特(Boldt),《美国昆虫学会纪事》(Annals of Entomological Society of America, 1971);谢尔顿(Shelton)等人《昆虫科学杂志》(J.Ent.Sci26:17))结合并且在适当的高浓度下进行菜蛾属生物测定。将4ml混合的有毒饮食倾倒在I盎司干净的塑料杯(Bioserve产品#9051)中。通过将无毒的饮食添加至之前的浓缩物中而制成后续的稀释物。一旦饮食冷却，将来自饮食适应的实验室菌落的5个新生小菜蛾(P.xyostella)放置在每个含有饮食的杯中，并且然后用白色纸盖(Bioserve产品#9049)进行覆盖。每个浓度测定20个幼虫。将这些杯的托盘放置在72° C的培养箱中持续3天， 该培养箱具有14:10 (小时)光暗周期。然后记录在每个杯中的活的幼虫的数目。表I
权利要求
1.一种包含719个氨基酸并且具有与SEQ ID NO:1至少99%的一致性的CrylI毒素，其中相应于位置140的氨基酸是谷氨酸(E)，相应于位置184的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置233的氨基酸是天冬氨酸(D)，相应于位置329的氨基酸是异亮氨酸(I)，相应于位置377的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置393的氨基酸是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)，相应于位置549的氨基酸是亮氨酸(L)，并且相应于位置712的氨基酸是亮氨酸(L)或谷氨酰胺(Q)。
2.如权利要求1所述的CrylI毒素，其中该CrylI毒素针对鳞翅目昆虫是有活性的并且针对鞘翅目昆虫是没有活性的。
3.一种分离的核酸分子，包含编码如权利要求1或权利要求2所述的CrylI毒素的一种核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成:SEQ ID NO:2 和 SEQ ID N0:4。
5.如权利要求3所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列已经针对在植物中的表达而被密码子优化。
6.如权利要求5所述的核酸分子，其中该优化的序列包含一个选自下组的序列，该组由以下各项组成:SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
7.一种嵌合基因，包括一个异源启动子序列，该启动子序列可操作地连接至如权利要求I至6中任一项所述的核酸分子上。
8.如权利要求7所述的嵌合基因，其中所述启动子是一种植物表达性启动子。
9.如权利要求8所述的嵌合基因，其中所述植物表达性启动子选自下组，该组由以下各项组成:泛素、cmp、 玉米TrpA、细菌噬菌体T3基因95’ UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、豌豆小亚基RuBP羧化酶、Ti质粒甘露碱合成酶、Ti质粒胭脂碱合成酶、牵牛花查尔酮异构酶、大豆富含甘氨酸蛋白1、马铃薯块茎特异蛋白、凝集素、CaMV35S、以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。
10.一种重组载体，包含如权利要求1至6中任一项所述的核酸分子。
11.如权利要求10所述的载体，进一步定义为一种质粒、粘粒、噬菌粒、人工染色体、噬菌体或病毒载体。
12.—种转基因非人类宿主细胞，包含如权利要求7所述的嵌合基因或如权利要求10所述的重组载体。
13.如权利要求12所述的转基因非人类宿主细胞，其中该转基因非人类宿主细胞是一种转基因植物细胞。
14.如权利要求13所述的转基因非人类宿主细胞，其中该转基因植物细胞选自下组，该组由以下各项组成:玉米、小麦、水稻、大豆、烟草、以及棉花。
15.一种转基因植物，包含如权利要求13所述的转基因植物细胞。
16.如权利要求15所述的转基因植物，其中该转基因植物选自下组，该组由以下各项组成:玉米、小麦、水稻、大豆、烟草、以及棉花。
17.—种衍生自如权利要求15所述的转基因植物的生物样品，其中所述生物样品包含核酸分子或杀虫蛋白。
18.如权利要求17所述的生物样品，其中所述杀虫蛋白保护所述样品免受昆虫侵染的影响。
19.如权利要求17或18所述的生物样品，其中所述样品选自下组，该组由以下各项组成:面粉、粗粉、油、以及淀粉、或一种从它们衍生的产品。
20.一种为农民提供控制鳞翅目害虫的手段的方法，所述方法包括向农民供应或出售植物材料,所述植物材料包含能够表达根据权利要求1所述的CrylI毒素的一种核酸分子。
21.—种产生如权利要求1所述的CrylI毒素的方法，包括以下步骤:(a)用一种包含编码该CrylI毒素的核苷酸序列的重组核酸分子转化一种非人类宿主细胞；并且(b)在步骤(a)的宿主细胞表达该重组核酸分子的条件下培养这种宿主细胞，由此产生CrylI毒素。
22.如权利要求21所述的方法，其中该非人类宿主细胞是一种植物细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其中该植物细胞是一种玉米细胞。
24.如权利要求21所述的方法，其中该重组核酸分子针对在植物中的表达而被密码子优化。
25.如权利要求21所述的方法，其中该重组核酸分子包含一种选自下组的序列，该组由以下各项组成:SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、以及 SEQ ID NO:6。
26.如权利要求25所述的方法，其中该重组核酸分子进一步包括一种启动子序列，该启动子序列可操作地连接至所述核苷酸序列以允许由该宿主细胞进行的该核苷酸序列的表达以及该CrylI毒素的产生。
27.如权利要求21所述的方法，其中该转化是通过土壤杆菌介导的转化、电穿孔、或微粒轰击而进行的。
28.一种减少在转基因植物中由鳞翅目昆虫和鞘翅目昆虫引起的虫害的一种方法，该方法包括:种植包含一个第一转基因和一个第二转基因的转基因植物种子，其中该第一转基因引起一种CrylI毒素的表达并且其中该第二转基因引起一种Cry3毒素的表达；由此减少由鳞翅目昆虫和鞘翅目昆虫引起的对从该转基因植物种子生长的转基因植物的损害。
29.如权利要求28所述的方法，其中该CrylI毒素包括719个氨基酸并且具有与SEQID NO:1至少99%的一致性，其中相应于位置140的氨基酸是谷氨酸(E)，相应于位置184的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置233的氨基酸是天冬氨酸(D)，相应于位置329的氨基酸是异亮氨酸(I )，相应于位置377的氨基酸是苏氨酸(T)，相应于位置393的氨基酸是苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)，相应于位置549的氨基酸是亮氨酸(L)，相应于位置712的氨基酸是亮氨酸(L)或谷氨酰胺(Q)。
30.如权利要求28所述的方法,其中该第一转基因包含一种选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成:SEQ ID NO : 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5 以及 SEQ ID NO: 6。
31.如权利要求28所述的方法，其中该Cry3毒素是一种修饰的Cry3A毒素。
32.如权利要求28所述的方法，其中该转基因植物选自下组，该组由以下各项组成:玉米、小麦、水稻、大豆、烟草、以及棉花。
33.如权利要求32所述的方法，其中该转基因植物是玉米。
34.一种来自权利要求15或16所述的转基因植物的转基因种子，其中该转基因种子包含该核酸分子。
35.一种控制作物害虫的方法，该方法包括提供提供如权利要求15或16所述的转基因植物或者权利要求34所述的种子，并且向该植物或该种子施用一种选自下组的活性成分，该组由以下各项组成:乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂、GABA-门控氯离子通道拮抗剂、钠通道调节剂/电压依赖性钠通道阻滞剂、烟碱型乙酰胆碱受体激动剂/拮抗剂、变构乙酰胆碱受体调节剂(激动剂)、氯离子通道激活剂、具有未知的或非特异性的作用机制的活性成分、氧化磷酸化抑制剂、ATP干扰剂、破坏H-质子梯度的氧化磷酸化去耦合剂、昆虫肠膜的微生物干扰剂、甲壳质生物合成抑制剂、蜕皮干扰剂、蜕皮激素激动剂/干扰剂、章鱼胺能激动剂、位点III电子传递抑制剂/位点II电子传递抑制剂、利阿诺定受体效应剂、脂肪酸生物合成抑制剂、具有未知作用机制的神经元抑制剂以及电子传递抑制剂。
36.如权利要求35所述的方法，其中该活性成分选自下组，该组由以下各项组成组成:棉铃威、涕灭威、涕灭砜威、除害威、灭害威、嚼虫威、丙硫克百威、合杀威、畜虫威、丁酮威、丁酮砜威、甲萘威、呋喃丹、丁硫克百威、除线威、敌蝇威、乙硫苯威、仲丁威、苯硫威、伐虫脒、呋线威、异丙威、威百亩、灭虫威、灭多威、速灭威、杀线威、抗蚜威、猛杀威、残杀威、硫双威、久效威、三甲威、XMC和灭杀威、乙酰甲胺磷、甲基吡噁磷、谷硫磷(-甲基、-乙基)、溴硫磷-乙基、溴苯烯磷(_甲基)、脱甲基丁卩密唳磷(butathiofos)、硫线磷、三硫磷、氯氧磷、氯芬磷、氯甲磷、毒死蜱(_甲基/_乙基)、蝇毒磷、苯腈磷、杀螟腈、氯芬磷、内吸磷-5-甲基、内吸磷-5-甲基砜、氯亚磷、二嗪磷、除线磷、敌敌畏/DDVP、百治磷、乐果、甲基毒虫畏、蔬果磷、乙拌磷(disulphoton)、EPN、乙硫磷、灭线磷、乙嘧硫磷、氨磺磷、苯线磷、杀螟硫磷、丰索磷、倍硫磷、批氟 硫磷、地虫硫磷、安果、丁苯硫磷、噻唑硫磷、庚烯磷、碘硫磷、异稻瘟净、氯唑磷、异柳磷、异丙基O-水杨酸酯、异噁唑磷、马拉硫磷、灭蚜磷、虫螨畏、甲胺磷、杀扑磷、速灭磷、久效磷、二溴磷、氧乐果、砜吸磷、对硫磷(_甲基/_乙基)、稻丰散、甲拌磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、磷虫威、辛硫磷、嘧啶磷(_甲基/_乙基)、丙溴磷、丙虫磷、胺丙畏、丙硫磷、发果、吡唑硫磷、哒嗪硫磷、哒硫磷、喹硫磷、硫线磷、治螟磷、硫丙磷、丁基嘧啶磷、双硫磷、特丁硫磷、杀虫畏、甲基乙拌磷、三唑磷、敌百虫、蚜灭磷、imicyafos、毒杀芬、氯丹、硫丹、Y -HCH> HCH、七氯、林旦、甲氧氯、乙酰虫腈、乙虫腈、氟虫腈、卩比嗪氟虫腈(pyrafIuprole)、卩比唳氟虫腈(pyriprole)、甲烯氟虫腈(vaniIiprole)、氟丙菊酯、烯丙菊酯(d-顺式-反式、d-反式)、β -氟氯氰菊酯、联苯菊酯、生物烯丙菊酯、生物烯丙菊酯-S-环戍基异构体、节呋烯菊酯(bioethanomethrin)、生物氯菊酯、除虫菊酯、二氯炔戍菊酯(chlovaporthrin)JiS -氯氰菊酯、顺式-节呋菊酯、顺式-氯菊酯、功夫菊酯(clocythrin)、乙氰菊酯、氟氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、氯氰菊酯(α-、β-、θ-、ξ-)、苯醚氰菊酯、溴氰菊酯、烯炔菊酯(IR异构体)、高氰戊菊酯、醚菊酯、五氟苯菊酯、甲氰菊酯、吡氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氟菊酯、氟氰菊酯、三氟醚菊酯、氟氯苯菊酯、氟胺氰菊酯、扫螨宝、Y-三氯氟氰菊酯、炔咪菊酯、噻恩菊酯、λ-三氯氟氰菊酯、甲氧苄氟菊酯、氯菊酯(顺式_、反式-)、苯醚菊酯(IR-反式异构体)、右旋炔丙菊酯、丙氟菊酯、丙苯烃菊酯(protrifenbute)、pyresmethrin、节呋菊酯、RU15525、氟娃菊酯、τ -氟胺氰菊酯、七氟菊酯、环戊烯丙菊酯、胺菊酯(IR异构体)、四溴菊酯、四氟菊酯、ΖΧΙ8901、除虫菊酯(除虫菊)、efIusilanat ;DDT、甲氧氯、唳虫脒、噻虫胺、呋虫胺、批虫啉、氯噻啉、烯唳虫胺、硝虫噻嗪、噻虫嗪、AKD-1022、烟碱、杀虫磺、杀螟丹、杀虫双、杀虫环(thiocylam)、多杀菌素、乙基多杀菌素、阿维菌素、埃玛菌素、苯甲酸埃玛菌素脂、伊维菌素、雷皮菌素、弥拜菌素、烯虫乙酯、烯虫炔酯、烯虫酯、保幼醚、烯虫硫酯、苯氧威、吡丙醚、苯虫醚、甲基溴、氯化苦、磺酰氟、冰晶石、卩比嗪酮、pyrifluquinazon、氟唳虫酰胺、四螨嗪、噻螨酮、乙螨唑、杀螨隆、三唑锡、三环锡、苯丁锡、克螨特、四氯杀螨砜、溴虫腈、乐杀螨、敌螨通、敌螨普、DNOC,苏云金芽孢杆菌菌株、bistrifluoron、定虫隆、除虫脲、批虫隆、氟环脲、氟虫脲、氟铃脲、氯芬新、双苯氟脲、多氟脲、氟幼脲、氟苯脲、杀铃脲、噻嗪酮、四氟菊酯、啶虫脒、环丙氨嗪、环虫酰肼、氯虫酰肼、甲氧虫酰肼、虫酰肼、呋喃虫酰肼(JS118)、印楝素、双甲脒、氟蚁腙、灭螨醌、嘧螨酯、丁氟螨酯、腈吡螨酯、喹螨醚、唑螨酯、嘧螨醚、哒螨灵、吡螨胺、唑虫酰胺、鱼藤酮、茚虫威、氰氟虫腙、螺螨酯、螺甲螨酯、特特拉姆酸、螺虫乙酯、联苯肼酯、氟虫双酰胺、(R) _，(S) -3-氯-N.sup.1-{2-甲基-4-[I, 2, 2，2-四氟 _1_( 二氟甲基)-乙基]苯基}-N.sup.2-(l-甲基-2-甲基磺酰基乙基)酞酰胺、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰虫酰胺(0}^2；^5^)、磺胺螨·酯、异噻虫唑(^611(3101:11132)、苯螨特、溴螨酯、噻嗪酮、灭螨猛、杀虫脒、乙酯杀螨醇、clothiazoben、cycloprene、开乐散、地昔尼尔、fenoxacrim、芳氟胺(fentrifanil)、氟螨噻、卩密虫胺、flutenzin、红铃虫性诱剂、日本金龟子性引诱剂、恶虫酮、石油、油酸钾、三氟甲吡醚、氟虫胺、杀螨好、苯螨噻以及增效炔醚，由此控制这些作物害虫。
全文摘要
在此披露了新颖的从苏云金芽孢杆菌分离的杀虫毒素，这些杀虫毒素针对鳞翅目害虫是有活性的。编码这些杀虫毒素的DNA可以用来转化各种原核和真核生物转化以表达这些杀虫毒素。这些重组生物可以用来控制在不同环境中的鳞翅目昆虫。
文档编号C07H21/04GK103228670SQ201180057232
公开日2013年7月31日 申请日期2011年11月22日 优先权日2010年12月13日
发明者V·克拉默 申请人:先正达参股股份有限公司