专利名称：一种Bt cry54Ab1基因及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Bt cry54Abl基因及其编码蛋白和应用。
背景技术：
在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌,它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins,简称ICPs), ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。自1981年Schn印f从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了 630多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N, etal.Microbiol Mol BiolRev,1998, 62:807-813;http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。现在已经分离克隆了 72个类群的杀虫蛋白。一般而言，Cry蛋白都是由单个操纵元编码的，如Cryl, Cry2, Cry3, Cry4和Cry9等毒蛋白，这些基因编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD;Cry54和Cry56等基因编码的杀虫晶体蛋白分子量为70_80kDa。随着对Bt杀虫基因研究的深入，一些具有两个操纵元编码的杀虫基因蛋白被予以发现，在这些cry基因当中，有一些类型cry基因与其序列后面的具有相同编码方向的orf2基因组成一个cry操纵子基因。这些cry操纵子基因由3部分组成，第一部分为一个cry基因编码60_80kDaCry蛋白，第二部分为一个orf2基因编码50-60kDa Orf2蛋白，以及位于两者之间一个约为30-80bp非编码的间隔序列。在以前的研究中，有些研究者认为orf2具有稳定crymRNA的作用，或者其编码的0rf2蛋白可能作为一个分子伴侣，有助于cry蛋白晶体的形成(Rosso ML, 1997.Appl Environ Microbiol63:4449-4455);有些研究者则认为 0rf2 蛋白对于稳定晶体构型具有重要的作用(J.Eleazar Barboza-Corona, 2012.Appl EnvironMicrobio178 (6): 2005-2012)。0rf2 蛋白与 Cryl> Cry4> Cry7> Cry8> Cry9 等大分子量 Cry蛋白的C端相类似，因此一些大分子的cry基因在进化过程中由于基因突变等因素造成完整的基因序列被分为两部分，形成由两个基因组成的cry基因操纵子(Thorne L, 1986.JBacteriology.166:801-811)。分子伴侣是细胞中一大类蛋白质，是一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，但不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份。一般而言，Cryl, Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130_140kDa，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensissubsp.1sraelensis,简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性,被广泛运用于蚊虫的防治。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(McGaughey，1985.Science.229:193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年,McGaughey 报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)在 Dipel (Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后,抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik B.E., et al.1994.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.91:4120-4124),上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.昆虫学报，39(3):238-244;Hofte H.，1988.Appl.Environ.Microbiol.54:2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf, E.，etal.1998.Mol.Biol.Rev.65(3): 775-806)。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(Georghiou G P, 19 97.Applied and Environmental Microbiology, 63:1095-1101.)。为避免抗性昆虫所造成的损失，许多针对于这个问题的方法被提出来，例如加大使用剂量和多基因协同使用，但是能从根本上解决这一问题的还是寻找新的、高毒力、宽杀虫谱的Bt基因资源，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种Bt cry54Abl基因及其编码蛋白和应用。本发明的目的是提供一种Bt cry54Abl基因，其具有(I)或(2)所示的核苷酸序列:(I) SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明还提供了一种Bt cry54Abl操纵子基因,所述cry54Abl操纵子基因包括一个cry54Abl基因、一个orf2基因以及它们之间的非编码间隔区，所述cry54Abl操纵子基因具有(I)或(2)所示的核苷酸序列:(I)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明通过对苏云金芽孢杆菌新菌株MC28 (保藏号为CGMCCN0.2719)基因组和质粒测序进行研究，发现该菌株存在一个新的cry操纵子基因，设计其全长基因引物，克隆得到cry54Abl操纵子基因的完整基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，全长为3823bp，包括一个2232bp的cry54Abl基因和一个1524bp的orf2基因以及它们之间67bp的非编码间隔区。分析表明，cry54Abl操纵子基因GC含量为32.28%。其中，所述苏云金芽孢杆菌新菌株MC28分离自四川省沐川原始森林地区土壤中，该菌株已于2008年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称〇6皿0:，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),保藏号为CGMCC N0.2719,已在申请号为200910078897.9的发明专利申请中公开。通过对MC28的毒力测试表明，MC28对鳞翅目害虫、双翅目害虫等均具有极高的毒力。其中，所述cry54Abl操纵子基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，cry54Abl基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。orf2基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。所述cry54Abl操纵子基因包括编码蛋白Cry54Abl和0rf2的核苷酸序列。其中，cry54Abl基因编码743个氨基酸组成的Cry54Abl蛋白；orf2基因编码507个氨基酸组成的0rf2蛋白。在softberry网站采用bacterial sigma7.0promoter程序对该操纵子中的cry基因进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将其命名为cry54Ablo本发明的目的是提供所述cry54Abl基因编码的蛋白。本发明的目的是提供一种Bt蛋白Cry54Abl，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。本发明还提供一种Bt蛋白Cry54Abl+0rf2,其包括蛋白Cry54Abl和蛋白Orf2,蛋白Cry54Abl的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，蛋白0rf2的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，蛋白Orf2为蛋白Cry54Abl的分子伴侣。Cry54Abl和Orf2蛋白的氨基酸组成如表I和表2。表lCry54Abl蛋白的氨基酸组成
权利要求
1.一种Bt cry54Abl基因，其特征在于，所述cry54Abl基因具有(I)或(2)所示的核苷酸序列: (1)SEQID N0.2所示的核苷酸序列； (2)SEQID N0.2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白。
3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白为Bt蛋白Cry54Abl，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
4.含有权利要求1所述cry54Abl基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pSTK-cry54Ablo
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，构建所述重组表达载体过程中扩增cry54Abl基因所用引物为:引物 CO-F:5’ -GCCGGATCCGATGTACAGGTGGGTTCTTGTTAAAC-3^ ；引物 C-R:5’ -CGCGTCGACTCAATTAATAAATAGATTATTCAC-3’。
7.含有权利要求4-6任一项所述重组表达载体的宿主细胞。
8.含有权利要求2或3所述蛋白的杀虫剂。
9.权利要求1所述的cry54Abl基因或权利要求3所述的Bt蛋白Cry54Abl在提高转基因植物抗虫性中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为将Cry54Abl基因与表达载体连接，得到能够表达Bt蛋白Cry54Abl的重组表达载体，再通过转基因方法将所述重组表达载体导入植物，得到含有Cry54Abl基因的转化体，表达Bt蛋白Cry54Abl，提高植物抗虫性。
全文摘要
本发明提供了一种Bt cry54Ab1基因及其编码蛋白和应用，所述cry54Ab1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，或为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。所述cry54Ab1基因编码的Bt蛋白Cry54Ab1可以用于制备Bt杀虫剂，cry54Ab1基因可以转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。
文档编号C12N15/32GK103103203SQ201310025478
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者郑爱萍, 李平, 关鹏, 余宗兰, 王世全, 邓其明, 刘怀年 申请人:四川农业大学