对鳞翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株及其杀虫基因和应用的制作方法

专利名称：对鳞翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株及其杀虫基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物防治技术领域，具体的，本发明涉及一株含有多种cry基因的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，它至少具有cry1Ac、cry1Ab、cry1C以及cryV重要杀虫基因的优良组合，对农业生产中的一些主要害虫，特别是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等鳞翅目害虫具有较高的活性。进一步，本发明涉及对鳞翅目有高毒力的Bt cry1Ac基因的核苷酸序列和其编码的蛋白质氨基酸序列，涉及在植物中表达的穿梭表达载体pCA-1Ac。
背景技术：
在农业生产过程中，虫害是造成农业生产损失的一个重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。为了减少这些损失，普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。
自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来(Adang M.J et al，Characterized full-length and truncated plasmid clones of the crystalprotein of Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta，Gene，1985，36(3)289～300.)，人们已经分离克隆了300多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N，Zeigler D R，Feitelson J，et al.Revision of the nomenclature for the Bacillusthuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。其中cry1类是一群同源性较高的基因，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，对鳞翅目害虫有特异毒性，并且许多基因目前已被广泛应用于植物的抗虫基因工程研究中，转基因植物已获得较好的抗虫性(Kozie M G，Beland G L，Bowman C，et al.Field performance of elite transgenic maizeplants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis.Bio/Technology，1993，11194-200；Perlak FJ，Deaton R W，Armstrong T A，et al.Insect resistant cotton plants.bio/technology，1990；8939-943；黄其満，毛立群，黄卫红等，转人工GFM cry1A基因烟草表现明显杀虫活性。植物学报，1998，40228-233)。Cry1Ac基因最初由Adang MJ和Staver MJ等人克隆，他们发现苏云金芽孢杆菌菌株HD-73产生的晶体蛋白对鳞翅目幼虫有极高的毒力，并将编码此晶体蛋白的基因从75kD的质粒上分离克隆出来。由于cry1Ac基因编码的晶体蛋白对鳞翅目中的粉纹夜蛾、烟芽夜蛾以及棉铃虫的毒力是最高的，所以有不少实验室都在对其进行研究。孙明、吴岚等人于1995年从菌株218中克隆了我国第一个cry1Ac基因，被国际命名委员会命名为cry1Ac10(孙明等，苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry218的克隆和表达，农业生物技术学报，1996)。1996年郭三堆等人将人工合成的调控序列和cry1Ac基因成功地导入多个棉花栽培品种，使我国成为国际上第二个独立开发成功转基因抗虫棉并获得知识产权的国家(崔洪志，郭三堆，中国农业科学，1996，29(1)93)。多年来，有关高毒力和新型杀虫活性的cry基因的开发和研究一直是国内外对Bt基因研究和利用的热点。

发明内容
本发明的目的是提供一种对农业生产中的一些主要害虫，特别是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等鳞翅目害虫具有较高毒力的苏云金芽孢杆菌Rpp02，以及来自于菌株Rpp02中的cry1Ac基因的序列及其编码的氨基酸序列，并将此序列用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性。
本发明的目的是通过实施如下的技术方案来实现的
1.含有多种cry基因的苏云金芽孢杆菌的筛选与鉴定本发明自行分离了Bt菌株Rpp02，土壤采自四川省成都温江地区。采用醋酸钠-抗生素分离法，称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养(200r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养。48h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片。发现一株含有菱形晶体形态的Bt菌株。该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)，苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种RPP02，已于2006年9月5日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NOM 206086。经用光学显微镜和电子显微镜观察，该菌株细胞呈杆状，两端钝圆，菌株大小为0.9-1.1μm×2.7-4.0μm，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大。革兰氏染色为阳性(G+)，抗酸染色为阴性。
2.菌株Rpp02中cry基因的鉴定根据cry1类基因保守序列设计几对特异引物cry1Ab5’-CGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTG-3’5’-GAGCCAAGATTAGTAGATTTTGTTAA-3’cry1Ac5’-ATCACTGAGTCGGTTCGCATGTTTGACTTTATC-3’5’-TCACTTCCCATCGACATCTACC-3’cry1C5’-CCACAGTTACACTCTGTAGCTC-3’5’-CACTTAATCCTGTGACGCCT-3’根据cryV类基因设计一对通用引物cryV5’-ATGAAACTAAAGAATCAAGA-3’5’-ACCTGTGCTATACAATTTCA-3’用下列PCR反应体系鉴定10×buffer 2.5ulMgCl2(25mM) 1.5ulTaq酶 0.2uldNTPs(2.5mM)2ul引物2ul
模板5ul最终反应体积25ul热循环反应94℃预变性5min；94℃变性1min，退火温度根据引物而定，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃停止反应。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。
3.菌株Rpp02中cry1Ac基因的克隆采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株Rpp02的总DNA，根据Genbank中cry1Ac的序列，设计其全长基因引物P1、P2(引物序列如下)，以菌株Rpp02总DNA为模板，扩增cry1Ac全长基因，得到长约4kb的片断，将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，转化，筛选到1个阳性克隆pGF10，经测序，得到序列SEQ ID NO1。
P15’AACCTGAGTTTGCATGAGAC3’P25’ATAATGGGCGAGAAGTAAGT3’4.cry1Ac基因的序列分析序列SEQ ID NO1的全长为3734bp，分析表明，其含有一个较大的开放阅读框ORF，位置是181-3714，GC含量为39.3％，编码1177个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。在softberry网站采用bacterial sigma7.0 promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列。该基因序列与已报道的cry1Ac序列同源性皆高达99％，彼此之间仅存在着少数几个核苷酸以及编码氨基酸的差别，被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ac20。本发明进一步分析了cry1Ac20蛋白的氨基酸组成(见表1)。
表1 cry1Ac20蛋白的氨基酸组成

5.cry1Ac20基因的表达将重组菌株DHF10在液体LB培养基(含60μg/ml氨苄青霉素)中37℃ 200r/min振荡培养过夜，收集培养物，离心获得菌体，加入10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)重悬，超声波破碎15min，离心收集沉淀，再用1/10体积的Na2CO3(50mmol/L，pH9.5)溶解，按常规SDS-PAGE方法检测表达产物。
6.cry1Ac20蛋白的活性检测将重组菌株DHF10在液体LB培养基(含60μg/ml氨苄青霉素)中37℃ 200r/min振荡培养3d；选老嫩适中的卷心菜叶片洗净，晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm2大小，分放在菌液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB浸泡叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；选放健康的2-3龄菜青虫试虫30头，重复3次，置室内，于1、2d后调查幼虫死亡情况，并计算其死亡率及校正死亡率。校正死亡率＝(试验组死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)。结果见表2，表明工程菌株对菜青虫具有极高的毒杀活性。
表2 工程菌DHF10对菜青虫的室内杀虫活性(48h)

7.cry1Ac20基因植物表达载体的构建本发明进一步根据克隆的cry1Ac基因全长序列，设计了在真核生物中表达此基因的引物P5和P6(引物序列如下)，引物P5和P6分别引入酶切位点Bgl II和Bst II，以质粒pGEM-F10为模板扩增，得到目的片断。再以pCAMBIA1301为骨架，用限制性内切酶Bgl II和BstE II双酶切将载体pCAMBIA1301上的GUS基因切除，再与相同双酶切后的目的片断连接，利用pCAMBIA1301上GUS基因的启动子启动目的基因的表达，构建了cry1Ac基因的遗传转化载体pCA-1Ac。
P55’AGTAGATCT(Bgl II)TTAACACCCTGGGTCA3’P65’GTGGGTAACC(BstE II)TGAGTTTGCATGAGA3’菌种保藏信息菌种名称芽孢杆菌属、苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种RPP02保藏机构中国典型培养物保藏中心保藏日期2006年9月5日保藏编号CCTCC NOM 20608

图1为Rpp02菌株的菱形伴孢晶体、芽孢及营养细胞(2500×)；图2为Rpp02菌株的营养细胞及稀疏的鞭毛(15000×)；图3为Rpp02菌株中cry基因型的PCR鉴定，其中M为DNA Marker DL2,0001为cry1Ab扩增产物2为cry1C扩增产物3为cryV扩增产物4为cry1Ac扩增产物；图4为重组质粒pGF10的PCR扩增产物，其中M为DNA分子量标准，1为cry1Ac PCR产物，2为ck；图5为重组菌株DHF10的SDS-PAGE分析，其中M为Molecular weight marker1为E.coli.DH5α without plasmid2为DHF10 with pGF10；图6为重组质粒pCA-1Ac的PCR扩增产物和酶切分析，其中M为λ-Hind III DNA Marker1为cry1Ac PCR扩增产物2为pCA-1Ac-Bgl II/BstE II3为pCAMBIA1301-Bgl II/BstE II。
具体实施例方式
实施例1 含有多种cry基因的苏云金芽孢杆菌的筛选与鉴定土壤采自四川省成都温江地区。采用醋酸钠-抗生素分离法，称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养(200r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养。48h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片。发现一株含有菱形晶体形态的Bt菌株(见附图1)。经用光学显微镜和电子显微镜观察，该菌株细胞呈杆状，两端钝圆，菌株大小为0.9-1.1μm×2.7-4.0μm，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大。革兰氏染色为阳性(G+)，抗酸染色为阴性(见附图2)。
实施例2 菌株Rpp02中cry基因的鉴定根据cry1类基因保守序列设计几对特异引物cry1Ab5’-CGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTG-3’
5’-GAGCCAAGATTAGTAGATTTTGTTAA-3’cry1Ac5’ATCACTGAGTCGGTTCGCATGTTTGACTTTATC-3’5’-TCACTTCCCATCGACATCTACC-3’cry1C5’-CCACAGTTACACTCTGTAGCTC-3’5’-CACTTAATCCTGTGACGCCT-3’根据cryV类基因设计一对通用引物cryV5’-ATGAAACTAAAGAATCAAGA-3’5’-ACCTGTGCTATACAATTTCA-3’用下列PCR反应体系鉴定10×buffer 2.5ulMgCl2(25mM) 1.5ulTaq酶 0.2uldNTPs(2.5mM)2ul引物2ul模板5ul最终反应体积25ul热循环反应94℃预变性5min；94℃变性1min，退火温度根据引物而定，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃停止反应。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果(见附图3)。
实施例3 菌株Rpp02中cry1Ac基因的克隆采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株Rpp02的总DNA，根据Genbank中cry1Ac的序列，设计其全长基因的引物P1和P2(引物序列如下)，以菌株Rpp02总DNA为模板，扩增cry1Ac全长基因，得到长约4k的片断，将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，转化，筛选到1个阳性克隆pGF10(见附图4)，经测序，得到SEQ ID NO1，该序列的全长为3734bp，分析表明，含有一个较大的开放阅读框ORF，其位置是181-3714，GC含量为39.3％，编码1177个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列的组成如SEQ ID NO2所示。在softberry网站采用bacterial sigma7.0 promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列。该基因序列与已报道的cry1Ac序列同源性皆高达99％，彼此之间仅存在着少数几个核苷酸以及编码氨基酸的差别，被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ac20。本发明进一步分析了此蛋白的氨基酸组成(见表1)，得知其分子量为133.144kDa，等电点为pH4.952。
P15’AACCTGAGTTTGCATGAGAC3’P25’ATAATGGGCGAGAAGTAAGT3’，实施例4 cry1Ac20基因的表达将重组菌株DHF10在液体LB培养基(含60μg/ml氨苄青霉素)中37℃ 200r/min振荡培养过夜，收集培养物，离心获得菌体，加入10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)重悬，超声波破碎15min，离心收集沉淀，再用1/10体积的Na2CO3(50mmol/L，pH9.5)溶解，按常规SDS-PAGE方法检测表达产物(见附图5)。
实施例5 cry1Ac20蛋白的活性检测将重组菌株DHF10在液体LB培养基(含60μg/ml氨苄青霉素)中37℃ 200r/min振荡培养3d；选老嫩适中的卷心菜叶片洗净，晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm2大小，分放在菌液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB浸泡叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；选放健康的2-3龄菜青虫试虫30头，重复3次，置室内，于1、2d后调查幼虫死亡情况，并计算其死亡率及校正死亡率。校正死亡率＝(试验组死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)。结果见表2，表明工程菌株对菜青虫具有极高的毒杀活性。
实施例6 cry1Ac20基因植物表达载体的构建本发明进一步根据克隆的cry1Ac基因全长序列，设计了在真核生物中表达此基因的引物p3和p4(引物序列如下)，引物p3和p4分别引入酶切位点Bgl II和BstE II，以质粒pGEM-F10为模板扩增，得到目的片断。再以pCAMBIA1301为骨架，用限制性内切酶Bgl II和BstE II双酶切将载体pCAMBIA1301上的GUS基因切除，再与相同双酶切后的目的片断连接，利用pCAMBIA1301上GUS基因的启动子启动目的基因的表达，构建了cry1Ac基因的遗传转化载体pCA-1Ac(见附图6)。
P55’AGTAGATCT(Bgl II)TTAACACCCTGGGTCA3’P65’GTGGGTAACC(BstE II)TGAGTTTGCATGAGA3’
序列表<110>李平 谭芙蓉 郑爱萍<120>对鳞翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株及其杀虫基因和应用<140>200610022151.2<141>2006-10-31<160>2<170>PatentIn 3.1<210>1<211>3734<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)<220>
<221>CDS<222>(181)...(3714)<400>1ataatgggcg agaagtaagt agattgttaa caccctgggt caaaaattga tatttagtaa 60aattagttgc actttgtgca ttttttcataagatgagtca tatgttttaa attgtagtaa120-35box -10boxtgaaaaacag tattatatca taatgaattg gtatcttaat aaaagagatg gaggtaactt 180atggataaca atccgaacac caatgaatgc attccttata attgtttaag taaccctgaa 240ORF →gtagaagtat taggtggaga aagaatagaa actggttaca ccccaatcga tatttccttg 300tcgctaacgc aatttctttt gagtgaattt gttcccggtg ctggatttgt gttaggacta 360gttgatataa tatggggaat ttttggtccc tctcaatggg acgcatttct tgtacaaatt 420gaacagttaa ttaaccaaag aatagaagaa ttcgctagga accaagccat ttctagatta 480gaaggactaa gcaatcttta tcaaatttac gcagaatctt ttagagagtg ggaagcagat 540cctactaatc cagcattaag agaagagatg cgtattcaat tcaatgacat gaacagtgcc 600cttacaaccg ctattcctct tttggcagtt caaaattatc aagttcctct tttatcagta 660tatgttcaag ctgcaaattt acatttatca gttttgagag atgtttcagt gtttggacaa 720
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170 175 180Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn Asp185 190 195Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val Arg Trp200 205 210Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp215 220 225Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val230 235 240Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Arg Tyr245 250 255Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn260 265 270Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln275 280 285Gly Ile Glu Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu290 295 300Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr Tyr305 310 315Trp Ser Gly His Gln Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly320 325 330Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala335 340 345Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg350 355 360Thr Leu Ser Ser Thr Phe Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile365 370 375Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr380 385 390Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly395 400 405Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn Val410 415 420Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His Val Ser Met425 430 435Phe Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg Ala Pro440 445 450Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile455 460 465Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn Phe470 475 480Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly485 490 495Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg
500 505 510Gly Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg515 520 525Tyr Arg Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu530 535 540Asn Val Asn Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro545 550 555Ala Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly560 565 570Tyr Phe Glu Ser Ala Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile575 580 585Val Gly Val Arg Asn Phe Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp590 595 600Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr605 610 615Asn Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser620 625 630Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn Val Thr Asp Tyr His Ile635 640 645Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu Ser Asp Glu Phe Cys650 655 660Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys665 670 675Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Ser Asn Phe Lys680 685 690Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp Gly Gly Ser Thr Gly695 700 705Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val710 715 720Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr725 730 735Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Phe Thr Arg Tyr Gln740 745 750Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu755 760 765Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr770 775 780Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys785 790 795Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp800 805 810Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser815 820 825His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn
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116011651170Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu1175 117权利要求
1.一种对鳞翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，其保藏编号为CCTCC NOM 206086。
2.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，其特征在于该菌株至少具有cry1Ac、cry1Ab、cry1C以及cryV杀虫基因组合。
3.如权利要求1或2所述的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，其特征在于从中分离克隆的cry1Ac基因包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，其特征在于所述cry1Ac基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，其特征在于构建的用于植物转基因的穿梭表达载体pCA-1Ac含有所述cry1Ac基因的核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02在防治蔬菜、棉花、玉米、水稻以及森林鳞翅目害虫中的应用。
全文摘要
本发明披露了对鳞翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株及其杀虫基因和应用，属于生物防治技术领域。本发明涉及一株具有多种高效杀虫基因的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，经PCR检测表明，它同时含有cry1Ac、cry1Ab、cry1C以及cry1V等多个基因。进一步，本发明涉及对鳞翅目高毒力的cry1Ac基因的核苷酸序列和其编码的蛋白质的氨基酸序列，同时还涉及包含此基因的穿梭表达载体pCA－1Ac及其构建方法。本发明通过将该序列应用于转化微生物和植物，从而表现出了对鳞翅目害虫的高毒性，克服或延迟了对工程菌和转基因植物抗药性的产生。
文档编号A01P7/04GK101074427SQ20061002215
公开日2007年11月21日 申请日期2006年10月31日 优先权日2006年10月31日
发明者李平, 谭芙蓉, 郑爱萍 申请人:李平, 谭芙蓉, 郑爱萍