专利名称：苏云金芽孢杆菌cryl基因、基因组合及表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物防治技术领域。进一步，本发明涉及一种对鳞翅目害虫具有活性地苏云金芽孢杆菌cry1基因、该基因的组合及其相应的表达载体。更进一步，本发明涉及对鳞翅目害虫高毒力的Bt cry1Ie基因的核苷酸序列和其编码的蛋白质的氨基酸序列，涉及协同组合使用cry1Ie基因与cry1Ab、cry1Ba等基因表达产物，还涉及表达上述基因序列的引物序列和本发明构建的广宿主穿梭表达载体pSXY422b。本发明的
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽孢的同时，能产生蛋白性质的伴孢晶体(parasporal crystal)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf，E.，N.等，Microbiol.And Molecular BiologyReview，1998，623 775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又称δ-内毒素(delta-endotoxin)，对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。
目前人们已经克隆了200多种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因，它们分属94种模式基因。其中cry1I基因是一类十分特殊的cry1类基因，主要具有以下的特点(1)编码81kDa的蛋白，对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有杀虫活性；(2)在Bt菌株中是沉默的，序列分析发现其上游不存在启动子序列；(3)距编码区上游500bp左右，一般与cry1类基因相邻，也称cry1-cry1I连锁(linkage of cry1-cry1I gene)，这种现象在Bt菌株中十分普遍；(4)在cry1与cry1I基因的间隔区存在强的转录终止序列(Gleave，A.P.等，Appl.Environ.Microbiol.，1993，591683-1687；Shin，B.S.等，Appl.Environ.Microbiol.，1995.61(6)2402-2407；Tailor，R.等，Mol.Microbiol.1992，61211-1217)。
1992年Tailor等从B.thuringiensis菌株4835中克隆了第一个cry1I基因，由于其具有双重的杀虫活性，命名为cryV。根据1998年Crickmore的分类系统更正为cry1Ia1(Crickmore等，1998)，该基因在菌株4835中是沉默的，但在转入大肠杆菌后获得表达，编码81.2kDa的毒蛋白，对鳞翅目的欧洲玉米螟(European corn borer，ECB)和鞘翅目的马铃薯甲虫(Leptinotarsa decernlineata)具有高活性。之后又发现多种cry1I类基因(Gleave，A.P.等，Appl.Environ.Microbiol.，1993，591683-1687；Shin，B.S.等，Appl.Environ.Microbiol.，1995，61(6)2402-2407；Choi，S.K.等，Curr.Microbiol.，2000，4165-69；Kostichka，K.等，J.Bacteriol.，1996，1782141-2144)。
Sekar等研究了Cry1Ia1蛋白的毒性区如果在C-末端去除71个氨基酸，则该蛋白对ECB的活性保持100％，而若去除184个氨基酸，则该蛋白的毒性完全丧失；而用胰蛋白酶处理得到的核心蛋白区(156-655或659)，只有全长蛋白的20％的活性；N端去除45个氨基酸的毒蛋白，则仍保持100％的毒性(Sekar，V.等，Appl.Environ.Microbiol.，1997，63(7)2798-2801)。
但是，目前世界上防治鳞翅目害虫所使用的Bt制剂以及转基因产品具有基因品种单一、害虫容易产生抗性、杀虫谱较窄等不足，如何改进它们就成为本领域的技术人员尤为关注的问题。本发明的内容
本发明的目的
针对上述不足，本发明的目的是提供一种对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)等鳞翅目重要害虫具有极高毒力的一种新的cry1I模式基因cry1Ie1序列和一种对亚洲玉米螟明显的增效作用cry1Ie1和cry1Ab基因的组合，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。进一步，为便于研究Bt杀虫蛋白基因在Bt受体菌中的表达，本发明构建一种含有cry3Aa7基因强启动子的Bt-Ecoli穿梭的表达载体；并通过建立一套有效的cry基因的Bt表达系统，为cry基因的Bt表达研究奠定基础；通过将cry1Ie1基因插入到上述载体，本发明可获得高效表达。
本发明的技术方案
1.在Btc007菌株中进行cry1Ie1基因的克隆。
人们通过利用cry基因的CAPS鉴定体系，鉴定了菌株Btc007的cry基因型(Kuo，W.S.和Chak，K.F.，Appl.Envir.Micro.1996，621369-1377；宋福平等，《中国农业科学》，1998，31(3)，13-18)。本发明发现它含有cry1Db、cry1Gb、cry1Fb、cry2Ab和一种新型cry1I基因。对其PCR产物及酶切进行电泳分析，得到电泳图谱(图1)。
通过Southern杂交(参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》(第二版)，金冬雁等译，1992，科学出版社)，得到Southern杂交结果(图2)，确定新的crylI基因在菌株Btc007质粒DNA上的位置。结果显示，cry1I基因位于2.5kb的Hind III和4.8kb的ClaI酶切片段上。
本发明用大肠杆菌-荧光假单胞菌穿梭载体pUCP19，克隆2.5kb HindIII酶切片段，重组质粒命名为pBTC191。对pBTC191进行酶切分析和PCR鉴定，得到电泳结果(图3)，结果证明该片段被克隆。通过酶切分析，选择EeoRI酶切pBTC191，产生三个片段1.0kb、1.1kb、5.0kb(0.5kb+pUCP19)。其中1.0kb、1.1kb两个片段用pBluescript SK(+)亚克隆命名为pSI-2、pSI-1，0.5kb+pUCP19自连命名为pSI-3。
亚克隆流程图参见附图(图4)。对亚克隆进行酶切，得出鉴定结果(图5)。将上述片段分别进行测序，发现缺少编码区5’末端的序列。为克隆全长cry1I基因，用载体pBluescript SK(+)克隆Btc007质粒DNA 4.8kb的ClaI酶切片段，命名为pXYI46，pXYI46的质粒图谱和酶切分析电泳图谱参见附图(图6)。
测定重组质粒pXY146所含cry1I基因的5’端序列，与pBTC191所含cry1I因序列进行拼接，得到完整的cry1I基因核苷酸序列，并推测出该基因编码蛋白质的氨基酸序列(cry1I基因的核苷酸序列和氨基酸序列及其配对，参见SEQ ID NO 1)。
进一步分析该cry1I因与已知四种cry1I基因的同源性，分别为cry1Ia1 93.1％、cry1Ib194.3％、cry1Ic1 92.6％和cry1Id1 89.2％。进一步分析该基因编码的蛋白质，编码区是308-2476bp，由719个氨基酸组成，氨基酸组成分析参见表1和附图(图7)。结果表明，其中的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和亮氨酸(Leu)含量最高。测得其等电点为pH5.91。
Cry1Ie蛋白的滴定曲线参见附图(图8)，其结果表明它是一种弱酸性蛋白质，分子量为81.0KDa。进行同源分析比较，确定Cry蛋白共有5个保守区(Block)，参见SEQ ID NO 1。其中，保守区1在186-202、保守区2在253-298、保守区3在491-536、保守区4在557-567、保守区5在634-643氨基酸之间。在编码区前未发现RBS序列，这也进一步证明cry1Ie1基因在Btc007菌株中是沉默的。
对Cry1Ie蛋白进行氨基酸序列同源性分析，表明它与其它四种Cry1I蛋白的同源性均低于95％，结果见表2。说明cry1Ie1基因是一种新型cry1I基因。本发明人在GenBank进行登记，登录号(Accession number)为AF211190。该基因也由Bt毒蛋白基因国际命名委员会命名为cry1Ie1基因。这是目前我国所发现的cry基因中分类等级最高的、第一个cry模式基因。
本发明比较了Cry1I模式(holotype)蛋白质氨基酸序列，结果见SEQ ID NO 2。用DNASIS等软件分析cry1Ie1基因序列，发现在同一开放阅读框下，有8个不同的起始密码子，共用一个终止密码子，编码8种蛋白，其起始位点、终止位点及编码蛋白质分子量参见表3。
2.cry1I基因在大肠杆菌中的表达及活性测定。
根据cry1Ie1基因序列，本发明设计了扩增全长cry1Ie1基因的一对引物S51Ie和S31Ie，并在5’-端引物加进BamHI切点，3`-端引物加进SalI切点，序列如下
BamHI
S51Ie5`-CGCGGATCCGATGAAACTAAAGAATCCAG-3`
SalI
S31Ie 5`-ACGCGTCGACGGCATGTTACGCTCAATATGG-3`
以pXYI46(含有cry1Ie1全长基因)为模板，本发明用S51Ie/S31Ie PCR扩增得到cry1Ie1全长基因片段(2.1kb)，导入载体pET-21b中，获得重组质粒命名为pETB-1IE。对pETB-1IE进行酶切和PCR检测，结果参见附图(图9)。pETB-1IE构建流程图见附图(图10)。测序结果表明pETB-1IE中的cry1Ie基因与cry1Ie1完全相同。
将cry1Ie1基因的表达载体pETB-1IE导入E.coli BL21(DE3)中，获得高效表达。对cry1Ie1基因表达产物进行SDS-PAGE，得到电泳结果(图11)。cry1Ie1基因表达产物为多条，分子量分别为83、81、60、57kDa，原因可能是因为不同的ATG起始造成的，参见表3。
诱导、收集菌体，超声破碎完全后，离心，把上清液和沉淀同时电泳，发现cry1Ie1基因表达产物在沉淀中，说明表达产物形成了包涵体。上清液与对照BL21(pET-21b)条带相似。而对于Cry1Ie1的出发菌株Btc007，没有发现表达81kDa的蛋白带。说明cry1Ie1基因在Btc007中是沉默的。
本发明通过SDS-PAGE分析，确定cry1Ie1基因表达产物的含量，完成对小菜蛾2龄幼虫和玉米螟初孵幼虫的杀虫活性测定。表4、表5分别为Cry1Ie1蛋白对亚洲玉米螟的生测结果。Cry1Ie1对亚洲玉米螟具有高毒力，LC50为16.21ppm，接近对玉米螟毒力最高的Cry1Ab蛋白。
表6为Cry1Ie1毒蛋白对小菜蛾的杀虫活性测定结果，表明对小菜蛾均具有毒力，LC50分别为197.88ng/mL(见表7)。Cry1Ie1活性较高。表8为Cry1Ie1对榆兰叶甲的生测结果，表明Cry1Ie1对鞘翅目害虫榆兰叶甲没有活性。
3.对Bt-E.coli穿梭强启动子表达载体的构建。
利用重叠引物PCR法，本发明把pET-21b载体的表达区启动子替换成cry3Aa7基因的启动子。设计了两对引物用于PCR扩增。以含cry3Aa7基因的质粒pBY33为模板，用SPE1/SPE2引物扩增得到cry3Aa7基因启动子片段，大小为560bp；以pET-21b载体为模板，用SPE3/SPE4引物扩增得到无启动子的pET-21载体的表达区片段，大小为226bp，SPE2、SPE3为一对重叠引物。以上述两个片段为模板，用SPE1/SPE4扩增得到带有cry3Aa7基因启动子、含pET-21载体的表达区序列的片段，大小为786bp，命名为3Aa-21b。SPE1、SPE4 5`端均引入SmaI切点。各引物序列见SEQ ID NO 3。
对PCR扩增产物进行检测，得到检测结果(图12)。结果显示，扩增得到了786bp的3Aa-21b片段。将片段3Aa-21用SmaI酶切，导入pHT315载体EcoRI/HindIII双酶切补平位点，得到重组质粒命名为pSXY422b。pSXY422b载体的构建流程图见附图(图13)。对pSXY422b进行酶切分析及PCR检测(图14)。测定pSXY422b的表达区序列(SEQ ID NO4)，结果标明cry3Aa7基因的启动子、STAB-SD序列、pET-21b中的T7 Tag、His Tag、转录终止子和酶切位点。
4.cry1Ie1基因在Bt菌株中的表达。
本发明把pETB-1IE中的cry1Ie1全长基因插入pSXY422b中的BamHI/SalI位点，得到重组质粒pSHY-1IE，对pSHY-1IE质粒进行酶切分析及PCR检测，得到电泳图谱(图15)。pSHY-1IE质粒的物理图谱参见附图(图16)。
用pSHY-1IE分别转化无晶体突变株BE20和Bt自然菌株UV-17，得到工程菌BiotIE01和BiotIE02，得到它们的PCR鉴定结果(图17)，证明表达载体转化成功。获得工程菌BiotIE01和BiotIE02在1/2LB平板上，30℃培养30个小时后，在光学显微镜下观察晶体，并拍摄照片(图18)。
对于Biot1IE01，观察不到典型的晶体形状，为不规则形状的包涵体。说明Cry1Ie1蛋白本身不能在无晶体突变株BE20中形成典型的晶体。BiotIE02观察到的晶体也不是典型的双锥体形。本发明比较了BiotIE01、BiotIE02、BE20、UV-17菌株的生长曲线(图19)，发现表达载体pSHY-1IE导入无晶体突变株BE20和野生菌株UV-17中，对它们的生长速率无影响。
在LB培养基上，30℃培养BE20、BiotIE01，30小时后，分别收集沉淀与上清，进行SDS-PAGE电泳检测，得到电泳结果(图20)。发现cry1Ie1基因在BE20中的表达产物处于上清液部分，分子量大约为83kDa。
30℃培养(LB)UV-17、BiotIE02，分别于6、10、14、18、22、26、30、34小时取样，离心收集沉淀，进行SDS-PAGE分析，结果表明(图21)，由于UV-17在80kDa左右也有一条带表达，所以无法判断BiotIE02是否表达了cry1Ie1基因。
用工程菌BiotIE01和BiotIE02培养液检测对小菜蛾的生物活性，结果见表9，说明工程菌株对小菜蛾表现出明显的活性。进一步验证了cry1Ie1基因在BE20获得表达。
本发明的有益效果
本发明涉及对鳞翅目害虫高毒力的Bt cry1Ie基因。利用本发明构建的广宿主穿梭表达载体pSXY422b，可将cry1Ie基因导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)、Bt菌株无晶体突变株BE20和自然菌株Bt17等菌株中，实现cry1Ie基因的高效表达。通过cry1Ie基因与cry1Ab、cry1Ba等基因表达产物组合，以产生对鳞翅目害虫的毒力高于出发菌株和单基因表达产物；而且cry1Ie基因与cry1Ab、cry1Ba等基因表达产物组合，扩大了对鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫的杀虫谱。通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。
此外，苏云金芽孢杆菌沉默基因cry1Ie DNA和氨基酸序列、鉴定该基因的引物序列和扩增全长基因的引物序列、基因组合增效方式以及穿梭表达载体为发明所独有。
图1为Btc007菌株PCR产物及酶切检测电泳结果；
图2为Btc007质粒DNA酶切及Southern杂交结果；
图3为重组质粒pBTC191的酶切及PCR鉴定结果；
图4为cry1I基因克隆及亚克隆流程图5为p1I-1、p1I-2和p1I-3质粒的酶切分析；
图6为pXYI46的质粒图谱和酶切分析电泳图7为Cry1Ie1氨基酸组成；
图8为Cry1Ie1的滴定曲线；
图9为重组质粒pETB-1IE的酶切分析及PCR检测；
图10为重组质粒pETB-1IE构建流程图11为cry1Ie1基因表达产物SDS-PAGE分析；
图12为3Aa-21b片段的扩增；
图13为pSXY422b的构建流程图14为pSXY422b的酶切及PCR检测结果；
图15为pSHY-1IE的酶切分析及PCR检测结果；
图16为pSHY-1IE质粒的物理图谱；
图17为工程菌BiotIE01、BiotIE02菌株中cry1Ie1基因的PCR检测；
图18为BiotIE01和BiotIE02的晶体观察(光学显微镜)；
图19为Bt菌株的生长曲线；
图20为BE20、BiotIE01的SDS-PAGE分析；
图21为Bt-17和BiotIE02不同时间的SDS-PAGE分析。具体实施方案
以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。
需特别指出的是，在本发明的实施例中，尽管详细描述了沉默基因的表达及其与不同基因的组合，但是这不意味着本发明的基因、基因组合只限于对Bt菌株进行转化和用于生产对上述害虫有抗性的Bt工程菌。因此，使用本发明所描述的新基因cry1Ie，使用本领域的普通技术人员所掌握的任何一种方法突变(含诱变)所获得的、对任何害虫有抗性的基因，使用cry1Ie与crylAb基因组合、cry1Ie与cry1Ba基因组合以提高对害虫的毒力和抗性、扩大杀虫范围，使用本发明构建的广宿主载体pSXY422b，以本领域的普通技术人员所掌握的任何一种方法导入任何微生物、植物或其组织、细胞中，以及由此所获得具有任何抗虫活性的微生物、植物，以及该类植物后代的种子、杂交和转育后代，均包括在本发明所要求的权利范围之内。
实施例1、cry1Ie1基因的鉴定与定位
利用cry基因的CAPS鉴定体系，本发明鉴定了菌株Btc007的cry基因型。发现含有cry1Db、cry1Gb、cry1Fb、cry2Ab和一种新型cry1I基因。图1为PCR产物及酶切分析电泳图谱。利用Southern杂交，确定了这一新的cry1I基因在菌株Btc007质粒DNA上的位置，图2为Southern杂交结果。发现该基因定位于2.5kb的HindIII和4.8kb的ClaI酶切片段上。
实施例2、cry1Ie1基因的克隆与亚克隆
用大肠杆菌-荧光假单胞菌穿梭载体pUCP19，本发明克隆了2.5kb HindIII酶切片段，重组质粒命名为pBTC191。图3为pBTC191的酶切分析及PCR鉴定电泳结果，证明克隆了该片段。通过酶切分析选择EcoRI酶切pBTC191，产生三个片段1.0kb、1.1kb、5.0kb(0.5kb+pUCP19)。其中1.0kb、1.1kb两个片段用pBluescript SK(+)亚克隆命名为pSI-2、pSI-1，0.5kb+pUCP19自连命名为pSI-3。图4为亚克隆流程图。图5为亚克隆酶切鉴定结果。将上述片段分别进行测序，发现缺少编码区5`末端的序列。为了克隆全长的cry1I基因，用载体pBluescript SK(+)克隆了Btc007质粒DNA 4.8kb的ClaI酶切片段，命名为pXYI46，图6为pXYI46的质粒图谱和酶切分析电泳图谱。
实施例3、cry1Ie1基因的序列分析
本发明测定重组质粒pXYI46所含cry1I基因5’端序列，并通过与pBTC191所含cry1基因序列拼接，得到完整的cry1I基因核苷酸序列，推测出该基因编码蛋白质的氨基酸序列，见SEQ ID NO 1。本发明进一步分析了该cry1I因与已知四种cry1I基因的同源性，分别为cry1Ia1 93.1％、cry1Ib1 94.3％、cry1Icl 92.6％和cry1Id1 89.2％。通过分析该基因编码的蛋白质，得知该基因的编码区是308～2476bp，由719个氨基酸组成，氨基酸组成分析见表1和图7，结果表明，丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和亮氨酸(Leu)含量最高。该蛋白质的等电点为pH5.91。由Cry1Ie蛋白的滴定曲线(图8)，可知该蛋白质是弱酸性蛋白质，分子量为81.0KDa。通过同源比较，确定了Cry蛋白共有5个保守区(SEQ ID NO 1)，其中，保守区1在186-202、保守区2在253-298、保守区3在491-536、保守区4在557-567、保守区5在634-643氨基酸之间。在编码区前未发现RBS序列，这也进一步证明cry1Ie1基因在Btc007菌株中是沉默的。
表1 Cry1Ie1氨基酸组成分析
通过氨基酸序列同源性分析，可知该蛋白质与其它四种Cry1I蛋白的同源性均低于95％(表2)。
表2 Cry1I蛋白质序列同源性(Identity)比较结果CryCry1Ie1 Cry1Ia1 Cry1Ib1Cry1Ic1 Cry1Id1Cry1Ie11.0000.934 0.949 0.916 0.877Cry1Ia1--- 1.000 0.927 0.899 0.897Cry1Ib1--- --- 1.000 0.949 0.872Cry1Ic1--- --- ---1.000 0.834Cry1Id1--- --- ------ 1.000
本发明比较Cry1I模式蛋白质氨基酸序列，结果见SEQ ID NO 2。用DNASIS等软件分析cry1Ie1基因序列，发现在同一开放阅读框下，有8个不同的起始密码子，共用一个终止密码子，编码8种蛋白，其起始位点、终止位点及编码蛋白质分子量见表3。
表3 cry1Ie1基因同一开放阅读框下编码的蛋白质
实施例4、PCR扩增cry1Ie1全长基因
根据cry1Ie1基因的序列，本发明设计了扩增全长cry1Ie1基因的一对引物，并在5’-端引物加进BamHI切点，3’-端引物加进Sal I切点，序列如下
BamHI
S51Ie5`-CGCGGATCCGATGAAACTAAAGAATCCAG-3`
SalI
S31Ie 5`-ACGCGTCGACGGCATGTTACGCTCAATATGG-3`
以pXYI46(含有cry1Ie1全长基因)为模板，用S51Ie/S31Ie PCR扩增得到cry1Ie1全长基因片段(2.1kb)。
实施例5、cry1Ie1基因在大肠杆菌中的表达
把在实施例4中得到的产物克隆于载体pET-21b中，获得重组质粒命名为pETB-1IE。图9为pETB-1IE的酶切及PCR检测结果，图10为pETB-1IE构建流程图。测序结果表明pETB-1IE中的cry1Ie基因与cry1Ie1完全相同。
将cry1Ie1基因的表达载体pETB-1IE导入E.coli BL21(DE3)中，获得高效表达。图11为cry1Ie1基因表达产物的SDS-PAGE电泳结果。cry1Ie1基因表达产物为多条，分子量分别为83、81、60、57kDa，原因可能是不同的ATG起始(表3)。诱导、收集菌体超声破碎完全后，离心，上清液和沉淀同时电泳，发现cry1Ie1基因表达产物在沉淀中，说明表达产物形成了包涵体。上清液与对照BL21(pET-21b)条带相似。Cry1Ie1的出发菌株Btc007，没有发现表达81kDa的蛋白带。说明cry1Ie1基因在Btc007中是沉默的。实施例6、cry1Ie基因杀虫活性研究
通过SDS-PAGE分析，确定cry1Ie1基因表达产物的含量，完成了对小菜蛾2龄幼虫和玉米螟初孵幼虫的杀虫活性测定。小菜蛾采用甘蓝叶片秤重后浸叶法，96小时调查结果；玉米螟采用人工饲料饲喂法，7天调查结果。表4、表5为Cry1Ie1蛋白对亚洲玉米螟的生测结果。Cry1Ie1对亚洲玉米螟具有高毒力，LC50为16.21ppm，接近对玉米螟毒力最高的Cry1Ab蛋白。表6为Cry1Ie1毒蛋白对小菜蛾的杀虫活性测定结果，表明对小菜蛾具有毒力，LC50分别为197.88ng/mL(见表7)。Cry1Ie1活性较高。
表4 Cry1Ie1对亚洲玉米螟(公主岭种群)杀虫活性处理代表 幼虫个数幼虫体重死亡率校正死亡率
感染 存活(mg) ％ 平均CK 1 48 46 400.4 4.17 4.86CK 2 48 48 416.1 0CK34843415.910.420.5ppm2 14844294.48.33 3.650.5ppm24845327.66.25 1.460.5ppm34843274.910.4210.425.1755ppm 1483780.5 22.9218.985ppm 2483456.8 29.1725.555ppm 3484262.2 12.5 8.03 17.5250ppm 148131.0 72.9271.5350ppm 248151.6 68.7567.1550ppm 348131.4 72.9271.5370.07100ppm1483 0.3 93.7593.43100ppm2485 0.5 89.5889.05100ppm3486 0.8 87.5 86.8689.78500ppm1480 100 100500ppm2480 100 100500ppm3480 100 100 100a1ppm10-6mg蛋白/mg干人工饲料
表5 Cry蛋白对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的毒力测定毒素LC50(低-高)ppma LC90(低-高)ppmCry1Ab 0.39(0.28-0.54) -Cry1Ie1 16.21(5.35-39.58) 134.39(2.43-998.70)a1ppm10-6mg蛋白/mg人工饲料干重
表6 Cry1Ie1对小菜蛾(Plutella xylostella)杀虫活性(48hr)样品浓度(ng/mL)Repeat 总计死亡死亡率(％)1 5.4×103 345 44 97.82 1.8×103 345 42 93.33 900345 39 86.74 300345 26 57.85 100345 15 33.3CK 无菌水 345 45 0
表7 Cry1I蛋白对小菜蛾杀虫活性毒素 LC50(90％confidence)ng/mL LC90(90％confidence)ng/mLCry1Ie1197.88(128.94-274.60) 1376.72(939.28-2426.94)
实施例7、Bt-E.coli穿梭强启动子及表达序列的扩增
利用重叠引物PCR法，本发明把pET-21b载体的表达区启动子替换成cry3Aa7基因的启动子。设计了两对引物用于PCR扩增。以含cry3Aa7基因的质粒pBY33为模板，用SPE1/SPE2引物扩增得到cry3Aa7基因启动子片段，大小为560bp(PCR条件同上)；以pET-21b载体为模板，用SPE3/SPE4引物扩增得到无启动子的pET-21载体的表达区片段(PCR条件同上)，大小为226bp，SPE2、SPE3为一对重叠引物，以上述两个片段为模板，用SPE1/SPE4扩增得到带有cry3Aa7基因启动子、含pET-21载体的表达区序列的片段，大小为786bp，命名为3Aa-21b。SPE1、SPE45`端均引入SmaI切点，各引物序列见SEQ IDNO 3。图12为PCR扩增产物检测结果。
实施例8、Bt-E.coli穿梭的构建
把在实施例7中扩增得到的786bp 3Aa-21b片段用SmaI酶切，导入pHT315载体EcoRI/HindIII双酶切补平位点，得到重组质粒命名为pSXY422b。图13为pSXY422b载体的构建流程图，图14为pSXY422b的酶切分析及PCR检测。测定了pSXY422b的表达区序列，SEQ ID NO 4为表达区的序列，标明了cry3Aa7基因的启动子，STAB-SD序列、pET-21b中的T7 Tag、His Tag、转录终止子和酶切位点。
实施例9、cry1Ie1基因的Bt表达载体构建
把pETB-1IE中的cry1Ie1全长基因插入pSXY422b中的BamHI/SalI位点，得到重组质粒pSHY-1IE，图15为pSHY-1IE质粒酶切分析及PCR检测电泳图谱。图16为pSHY-1IE质粒的物理图谱。
实施例10、cry1Ie1基因在Bt菌株中的表达
把pSHY-1IE分别转化无晶体突变株BE20和Bt自然菌株Bt-17，得到工程菌BiotIE01和BiotIE02，图17为它们的PCR鉴定结果，证明表达载体转化成功。获得工程菌BiotIE01和BiotIE02在1/2LB平板上30℃培养30个小时后，在光学显微镜下观察晶体。图18为光学显微镜下观察晶体的结果。Biot1IE01观察不到典型的晶体形状，为不规则形状的包涵体。说明Cry1Ie1蛋白本身不能在无晶体突变株BE20中形成典型的晶体。BiotIE02观察到的晶体电不是典型的双锥体形。比较了BiotIE01、BiotIE02、BE20、Bt-17菌株的生长曲线，发现表达载体pSHY-1IE导入无晶体突变株BE20和野生菌株Bt-17中，对它们的生长速率无影响。图19为它们的生长曲线。
在LB培养基30℃培养BE20、BiotIE01，30小时后，分别收集沉淀与上清，SDS-PAGE电泳检测(图20)，发现cry1Ie1基因在BE20中的表达产物在上清液，分子量大约为83kDa。
30℃培养(LB)Bt-17、BiotIE02，分别于6、10、14、18、22、26、30、34小时取样，离心收集沉淀，SDS-PAGE分析(如图21)，结果表明，cry1Ie1基因表达了80kDa左右的条带。
用工程菌BiotIE01和BiotIE02培养液检测对小菜蛾的生物活性，结果见表8，说明工程菌株对小菜蛾表现出明显的活性，从而进一步验证了cry1Ie1基因在BE20获得表达。
表8 Bt菌株对小菜蛾幼虫的活性测定样品 重复总虫数 死虫数 死亡率％校正死亡率％BiotIE01/cry1Ie1 3 36 36 100 100BiotIE02/cry1Ie1 3 36 36 100 100BE20/cry- 3 36 7 19.4-附本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列SEQ ID NO 1(cry1Ie1基因的核苷酸序列和氨基酸序列)1CGATGAAAATATCTCTGCTTTTTCTTTCTTTATTTGGTATATGCTTTACTTGTAATCGAA 6061AATAAAGCACTAATAAGAGTATTTATAGGTGTTTGAAGTCATTTCAGTTCATTTTTAAAG 120121GAGGTTTAAAAGTGTTAGAAAGTTATTAAGGAATAATACTTACAGTAAATCCTACCTATA 180181TTTTACAATTAATTATGATATTTATGCATAAATTAAAAATGCTTTATTTGACATTACAGC 240241TAAGTATAATTTTTTATGAATAAAATTTTATTTGAAAATTAAATAATATTATATGTGAGG 300301GATTAATATGAAACTAAAGAATCCAGATAAGCATCAAAGCTTGTCTAGCAATGCGAAAGT 360 1 M K L K N P D K H Q S L S S N A K V18361AGATAAAATCGCTACGGATTCACTAAAAAATGAAACAGATATAGAATTGAAAAATATTAA 420 19 D K I A T D S L K N E T D I E L K N I N38421TCATGAGGATTTCCTAAGAATGTCTGAGCATGAGAGTATTGATCCGTTTGTTAGTGCATC 480 39 H E D F L R M S E H E S I D P F V S A S58481AACAATTCAAACGGGTATTGGAATTGCTGGTAAGATTCTTGGTACTCTAGGTGTTCCTTT 540 59 T I Q T G I G I A G K I L G T L G V P F78541TGCTGGACAAATAGCTAGCCTCTATAGTTTTATCTTAGGGGAGCTTTGGCCTAAAGGGAA 600 79 A G Q I A S L Y S F I L G E L W P K G K98601AAGTCAATGGGAAATCTTTATGGAACATGTAGAAGAGCTTATTGACCAAAAAATATCAAC 660 99 S Q W E I F M E H V E E L I D Q K I S T118661TTACGCAAGAAACATAGCACTTGCAGATTTAAAAGGCTTAGGAGATGCTTTGGCTGTCTA 720119 Y A R N I A L A D L K G L G D A L A V Y138721CCATGAATCGCTTGAAAGTTGGATTAAAAATCGCAACAACGCAAGGGCTACAAGTGTTGT 780139 H E S L E S W I K N R N N A R A T S V V159781CAAGAGCCAATATATTGCTTTAGAACTATTGTTTGTTCAAAGCTGCCTTCTTTTGCAGT 840159 K S Q Y I A L E L L F V Q K L P S F A V178841ATCAGGTGAGGAAGTACCATTATTGCCAATATATGCACAAGCTGCAAATTTACACTTATT 900179 S G E E V P L L P I Y A Q A A N L H L L198
Block1901ATTACTAAGAGATGCTTCTGTTTTTGGAAAAGAGTGGGGATTATCTAATTCGCAAATTTC 960199 L L R D A S V F G K E W G L S N S Q I S218961TACATTTTATAATCGTCAAGTCGAAAGAACGAGTGACTATTCCGACCATTGTGTGAAATG 1020219 T F Y N R Q V E R T S D Y S D H C V K W2381021GTATAGTACAGGTCTAAATAACTTGAGAGGTACAAATGCCGAAAGCTGGGTCCGTTATAA 1080239 Y S T G L N N L R G T N A E S W V R Y N2581081TCAATTTCGTAAAGATATGACATTAATGGTACTAGATTTAATCGCATTATTCCCAAGCTA 1140259 Q F R K D M T L M V L D L I A L F P S Y278
Block21141TGATACACTTGTATATCCAATTAAAACCACTTCTCAACTTACAAGAGAAGTATATACAGA 1200279 D T L V Y P I K T T S Q L T R E V Y T D2981201CGCAATTGGGACAGTACATCCAAATGCAAGTTTTGCAAGTACGACCTGGTATAATAATAA 1260299 A I G T V H P N A S F A S T T W Y N N N3181261TGCACCTTCGTTCTCTGCCATAGAGTCTGCTGTTGTTCGAAACCCGCATCTACTCGATTT 1320319 A P S F S A I E S A V V R N P H L L D F3381321TTTAGAACAAGTTACAATTTACAGCTTATTAAGTAGGTGGAGTAACACTCAGTATATGAA 1380339 L E Q V T I Y S L L S R W S N T Q Y M N3581381TATGTGGGGAGGACATAGACTGGAATTCCGAACAATAGGTGGAGTGTTAAATACCTCAAC 1440359 M W G G H R L E F R T I G G V L N T S T3781441ACAAGGGTCTACTAATACTTCTATTAATCCTGTAACATTACCGTTCACGTCTCGAGACGT 1500379 Q G S T N T S I N P V T L P F T S R D V3981501CTATAGGACTGAATCATTGGCAGGGCTGAATCTATTTTTAACTCAACCTGTTAATGGAGT 1560399 Y R T E S L A G L N L F L T Q P V N G V4181561ACCTAGGGTTGATTTTCATTGGAAATTCGCCACACTTCCGATTGCATCTGATAATTTTTA 1620419 P R V D F H W K F A T L P I A S D N F Y4381621TTATCTAGGGTATGCTGGAGTTGGTACGCAATTACAAGATTCAGAAAATGAATTACCACC 1680439 Y L G Y A G V G T Q L Q D S E N E L P P4581681TGAAACAACAGGACAGCCAAATTATGAATCATATAGTCATAGATTATCCCATATAGGACT 1740459 E T T G Q P N Y E S Y S H R L S H I G L4781741CATTTCAGCATCCCACGTGAAAGCATTGGTATATTCTTGGACACATCGTAGTGCAGATCG 1800479 I S A S H V K A L V Y S W T H R S A D R4981801TACAAATACAATTGAGCCAAATAGCATTACACAAATACCATTAGTAAAAGCGTTCAATCT 1860499 T N T I E P N S I T Q I P L V K A F N L518
Block31861GTCTTCAGGTGCCGCTGTAGTGAGAGGACCAGGATTTACAGGTGGGGATATCCTTCGAAG 1920519 S S G A A V V R G P G F T G G D I L R R5381921AACGAATACTGGTACATTTGGGGATATACGAGTAAATATTAATCCACCATTTGCACAAAG 1980539 T N T G T F G D I R V N I N P P F A Q R5581981ATATCGCGTGAGGATTCGCTATGCTTCTACTACAGATTTACAATTCCATACGTCAATTAA 2040559 Y R V R I R Y A S T T D L Q F H T S I N578
Block42041CGGTAAAGCTATTAATCAAGGTAATTTTTCAGCAACTATGAATAGAGGAGAGGACTTAGA 2100579 G K A I N Q G N F S A T M N R G E D L D5982101CTATAAAACCTTTAGAACTGTAGGCTTTACCACTCCATTTAGCTTTTCAGATGTACAAAG 2160599 Y K T F R T V G F T T P F S F S D V Q S6182161TACATTCACAATAGGTGCTTGGAACTTCTCTTCAGGTAACGAAGTTTATATAGATCGAAT 2220619 T F T I G A W N F S S G N E V Y I D R I638
Block52221TGAATTTGTTCCGGTAGAAGTAACATATGAGGCAGAATATGATTTTGAAAAAGCGCAAGA 2280639 E F V P V E V T Y E A E Y D F E K A Q E6582281GAAGGTTACTGCACTGTTTACATCTACGAATCCAAGAGGATTAAAAACAGATGTAAAGGA 2340659 K V T A L F T S T N P R G L K T D V K D6782341TTATCATATTGACCAGGTATCAAATTTAGTAGAGTCTCTATCAGATGAATTCTATCTTGA 2400679 Y H I D Q V S N L V E S L S D E F Y L D6982401TGAAAAGAGAGAATTATTCGAGATAGTTAAATACGCGAAGCAAATCCATATTGAGCGTAA 2460699 E K R E L F E I V K Y A K Q I H I E R N7182461CATGTAGAATTAAAATCTACCTAAATCCAGAAAAATAAAAGGGTTAAATATACAATTCTT 2520719 M *2521GTACCAATATTTTGAGTGATTAGATGTAGGATGAAATTTAATTGTATGCTATTTAACAGT 25802581AGAGATATTAAAAATTAATTTATCTATACATTAATAGTATAGACATACAAACATAAGAGA 26402641GCATTGTCTTTTCGTAGGCTACAATGCTCTCTATTTACTATTTATTTTTCTTTTGTATCT 27002701TCAAATTGACGTTGTTCTAAGCGTTCTATTGCAGCTCGTCGTTTAGTATCATCAATGTTT 27602761GTATAAAGAGATGTTGTTTCCATAGAATTATGTCCCATTTGATTTGCTAATAATACTAAA 28202821TCTTTATTTTCATTATAGTGATTAGTAGCATAAGTATGACGTAATTTATGAGGGCTTTTC 28802881 TTTTCATCAAAAGCCCTTGTGTATTTCTCTGTAAGCTT2918SEQ ID NO 2(Cry1I蛋白的氨基酸序列比较)
10 20 30 40 50 60Cry1Ie1MKLKNPDKHQ SLSSNAKVDK IATDSLKNET DIELKNINHE DFLRMSEHES IDPFVSASTICry1Ia1MKLKNQDKHQ SFSSNAKVDK ISTDSLKNET DIELQNINHE DCLKMSEYEN VEPFVSASTICry1Ib1MKLKNPDKHQ SLSSNAKVDK IATDSLKNET DIELKNMNNE DYLRMSEHES IDPFVSASTICry1Ic1MKLKNPDKHQ TLSSNAKVDK IATDSLKNET DIELKNMNNE DYLRMSEHES IDPFVSASTICry1Id1MKSKNQNMYR SFSSNATVDK SFIDPLEHNT NMELQNSNHE DCLKMSEYES VEPFVSVSTI
70 80 90100110120Cry1Ie1QTGIGIAGKI LGTLGVPFAG QIASLYSFIL GELWPKGKSQ WEIFMEHVEE LIDQKISTYACry1Ia1QTGIGIAGKI LGTLGVPFAG QVASLYSFIL GELWPKGKNQ WEIFMEHVEE IINQKISTYACry1Ib1QTGIGIAGKI LGTLGVPFAG QIASLYSFIL GELWPKGKSQ WEIFMEHVEE IINQKILTYACry1Ic1QTGIGIAGKI LGTLGVPFPG QIASLYSFIL GELWPKGKSQ WEIFMEHVEA IINRKISTYACry1Id1QTGIGIAGKI LGNLGVPFAG QVASLYSFIL GELWPKGKSQ WEIFMEHVEE LINQKISTYA
130140150160170180Cry1Ie1RNIALADLKG LGDALAVYHE SLESWIKNRN NARATSVVKS QYIALELLFV QKLPSFAVSGCry1Ia1RNKALTDLKG LGDALAVYHD SLESWVGNRN NTRARSVVKS QYIALELMFV QKLPSFAVSGCry1Ib1RNKALSDLRG LGDALAVYHE SLESWVENRN NTRARSVVKN QYIALELMFV QKLPSFAVSGCry1Ic1RNKALTDLKG LGDALAVYHE SLESWVGNRN NTRARSVVKN QYIALELMFV QKLPSFAVSGCry1Id1RNKALADLKG LGDALAVYHE SLESWIENRN NTRVRSVVKN QYIALELMFV QKLPSFAVSG
190200210220230240Cry1Ie1EEVPLLPIYA QAANLHLLLL RDASVFGKEW GLSNSQISTF YNRQVERTSD YSDHCVKWYSCry1Ia1EEVPLLPIYA QAANLHLLLL RDASIFGKEW GLSSSEISTF YNRQVERAGD YSYHCVKWYSCry1Ib1EEVPLLPIYA QAANLHLLLL RDASIFGKEW GLSASEISTF YNRQVERTRD YSDHCIKWYNCry1Ic1EEVPLLPIYA QAANLHLLLL RDASIFEKNG GLSASEISTF YNRQVERTRD YSYHCVKWNNCry1Id1EEVPLLPIYA QAANLHLLLL RDASIFGKEW GLSESEISTF YNRQSSQTQE YSDYCSEWYN
250260270280290300Cry1Ie1TGLNNLRGTN AESWVRYNQF RKDMTLMVLD LIALFPSYDT LVYPIKTTSQ LTREVYTDAICry1Ia1TGLNNLRGTN AESWVRYNQF RRDMTLMVLD LVALFPSYDT QMYPIKTTAQ LTREVYTDAICry1Ib1TGLNNLRGTN AKSWVRYNQF RKDMTLMVLD LVALFPSYDT LVYPIKTTSQ LTREVYTDAICry1Ic1TGLNNLRATN GQSWVRYNQF RKDIELMVLD LVRVFPSYDT LVYPIKTTSQ LTREVYTDAICry1Id1TGLNRLRGTN AESWVRYNQF RRDMTLMVLD LVALFPSYDT RMYPIPTSAQ LTREVYTDAI
310320330340350360Cry1Ie1 GTVHPNASFA STTWYNNNAP SFSAIESAVV RNPHLLDFLE QVTIYSLLSR WSNTQYMNMWCry1Ia1 GTVHPHPSFT STTWYNNNAP SFSAIEAAVV RNPHLLDFLE QVTIYSLLSR WSNTQYMNMWCry1Ib1 GTVHPNQAFA STTWYNNNAP SFSAIEAAVI RSPHLLDFLE KVTIYSLLSR WSNTQYMNMWCry1Ic1 GTVDPNQALR STTWYNNNAP SFSAIEAAVI RSPHLLDFLE KVTIYSLLSR WSNTQYMNMWCry1Id1 GTVHPNASFA STTWYNNNAP SFSTIEAAVV RNPHLLDFLE QVTIYSLLSR WSNTQYMNMW
370380390400410420Cry1Ie1 GGHRLEFRTI GGVLNTSTQG STNTSINPVT LPFTSRDVYR TESLAGLNLF LTQPVNGVPRCry1Ia1 GGHKLEFRTI GGTLNISTQG STNTSINPVT LPFTSRDVYR TESLAGLNLF LTQPVNGVPRCry1Ib1 GGHRLESRPI GGALNTSTQG STNTSINPVT LQFTSRDVYR TESLAGLNLF LTQPVNGVPRCry1Ic1 GGHRLESRPI GGALNTSTQG STNTSINPVT LQFTSRDFYR TESWAGLNLF LTQPVNGVPRCry1Id1 GGHKLEFRTI GGTLNTSTQG STNTSINPVT LPFTSRDVYR TESLAGLNLF LTQPVNGVPR
430440450460470480Cry1Ie1 VDFHWKFATL PIASDNFYYL GYAGVGTQLQ DSENELPPET TGQPNYESYS HRLSHIGLISCry1Ia1 VDFHWKFVTH PIASDNFYYP GYAGIGTQLQ DSENELPPEA TGQPNYESYS HRLSHIGLISCry1Ib1 VDFHWKFPTL PIASDNFYYL GYAGVGTQLQ DSENELPPET TGQPNYESYS HRLSHIGLISCry1Ic1 VDFHWKFPTL PIASDNFYYL GYAGVGTQLQ DSENELPPET TGQPNYESYS HRLSHIGLISCry1Id1 VDFHWKFVTH PIASDNFYYP GYAGIGTQLQ DSENELPPET TGQPNYESYS HRLSHIGLIS
490500510520530540Cry1Ie1 ASHVKALVYS WTHRSADRTN TIEPNSITQI PLVKAFNLSS GAAVVRGPGF TGGDILRRTNCry1Ia1 ASHVKALVYS WTHRSADRTN TIEPNSITQI PLVKAFNLSS GAAVVRGPGF TGGDILRRTNCry1Ib1 ASHVKALVYS WTHRSADRTN TIEPNSITQI PLVKAFNLSS GAAVVRGPGF TGGDILRRTNCry1Ic1 GSHVKALVYS WTHRSADRTN TIEPNSITQI PLVKAFNLSS GAAVVRGPGF TGGHILRRTKCry1Id1 ASHVKALVYS WTHRSADRTN TINSDSITQI PLVKAFNLPS GASVVRGPGF TGGDILQRTN
550560570580590600Cry1Ie1 TGTFGDIRVN INPPFAQRYR VRIRYASTTD LQFHTSINGK AINQGNFSAT MNRGEDLDYKCry1Ia1 TGTFGDIRVN INPPFAQRYR VRIRYASTTD LQFHTSINGK AINQGNFSAT MNRGEDLDYKCry1Ib1 TGTFGDIRVN INPPFAQRYR VRIRYASTTD LQFHTSINGK AINQGNFSAT MNRGEDLDYKCry1Ic1 SGTFGHIRVN INPPFAQRYR VRMSYASTTD LQFHTSINGK AINQGNFSAT MNRGEDLDYKCry1Id1 TGTFGDIRVN INPPFAQRYR LRIRYASTTN LEFHTSINGK AINQGNFSAT MNRGEDLDYK
610620630640650660Cry1Ie1 TFRTVGFTTP FSFSDVQSTF TIGAWNFSSG NEVYIDRIEF VPVEVTYEAE YDFEKAQEKVCry1Ia1 TFRTVGFTTP FSFLDVQSTF TIGAWNFSSG NEVYIDRIEF VPVEVTYEAE YDFEKAQEKVCry1Ib1 TFRTIGFTTP FSFSDVQSTF TIGAWNFSSG NEVYIDRIEF VPVEVTYEAE YDFEKAQEKVCry1Ic1 TFRTVGFTTP FSFSDVQSTF TIGAWNFSSG NEVYIGRIEF VPVEVTYEAE YDFEKAQEKVCry1Id1 AFRTVGFTTP FSFSNAQSTF TIGAWNFSLG NEVYIDRIEF VPVEVTYEAE YDLKKAQDEI
670680690700710Cry1Ie1 TALFTSTNPR GLKTDVKDYH IDQVSNLVES LSDEFYLDEK RELFEIVKYA KQIHIERNMCry1Ia1 TALFTSTNPR GLKTDVKDYH IDQVSNLVES LSDEFYLDEK RELFEIVKYA KQLHIERNMCry1Ib1 TALFTSTNPR GLKTDVKDYH IDQVSNLVES LSDEFYLDEK RELFEIVKYA KQIHIERNMCry1Ic1 TALFTSTNPR GLKTDVKDYH IDQVSNLVES LSDELYLDEK RELFEIVKYA KQIHIERNMCry1Id1 TAMFTSTNLR RLKTNVTDCH IDQVSNLVES LSDEFYLDEK RELFEIVKYA KQLNIERNMSEQID NO 3
SmaI
SPE15`-TCCCCCGGGAGCTTAATTAAAGATAATATC-3`
SPE25`-TTTTCTTCCTCCCTTTC-3`
Complement sequence
SPE35`-GGAGGAAGAAAAATGGCTAGCATGACTGGTGGAC-3`
SmaI
SPE45`-TCCCCCGGGCAAAAAACCCCTCAAGACCCG-3`SEQ ID NO 4(pSXY422b表达区序列及分析)1GGGAGCTTAATTAAAGATAATATCTTTGAATTGTAACGCCCCTCAAAAGTAAGAACTACA 60
cry3Aa7 promoter→61AAAAAAGAATACGTTATATAGAAATATGTTTGAACCTTCTTCAGATTACAAATATATTCG 120121GACGGACTCTACCTCAAATGCTTATCTAACTATAGAATGACATACAAGCACAACCTTGAA 180181AATTTGAAAATATAACTACCAATGAACTTGTTCATGTGAATTATCGCTGTATTTAATTTT 240241CTCAATTCAATATATAATATGCCAATACATTGTTACAAGTAGAAATTAAGACACACTTGA 300301TAGCCTTACTATACCTAACATGATGTAGTATTAAATGAATATGTAAATATATTTATGATA 360361AGAAGCGACTTATTTATAATCATTACATATTTTTCTATTGGAATGATTAAGATTCCAATA420
STAB-SD421GAATAGTGTATAAATTATTTATCTTGAAAGGAGGGATGCCTAAAAACGAAGAACATTAAA 480481AACATATATTTGCACCGTCTAATGGATTTATGAAAAATCATTTTATCAGTTTGAAAATTA 540
T7 Tag541TGTATTATGATAAGAAAGGGAGGAAGAAAAATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATG 600
M A S M T G G Q Q M
BamHI EcoRI SacI SalI HindIII NotI XhoI601GGTCGGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCAC 660 G R D P N S S S V D K L A A A L E H H H661CACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCC 720
H H H T7 terminator 721ACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTT 780781TTGCCC78权利要求
1.一种Bt基因cry1Ie1的基因序列，其特征是该序列具有如SEQ ID NO 1所示的DNA序列，且编码具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的蛋白质；
2.权利要求1的基因序列，其中所说的基因序列包括该基因序列的部分序列；
3.权利要求1的基因序列，其中所说的基因序列包括该基因序列的同源序列；
4.权利要求1的基因序列，其中所说的基因序列编码对昆虫具有活性的蛋白质；
5.权利要求1的基因序列，其中所说的基因序列编码对鳞翅目昆虫具有活性的蛋白质；
6.一种对昆虫具有活性的蛋白质的氨基酸序列，其特征是该蛋白质的氨基酸序列是由权利要求1的基因序列所编码，且具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；
7.权利要求6的氨基酸序列，其中所说的氨基酸序列是如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的部分序列；
8.权利要求6的氨基酸序列，其中所说的氨基酸序列是如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的同源序列；
9.权利要求6的氨基酸序列，其中所说的昆虫是鳞翅目昆虫；
10.一种用于扩增权利要求1的基因序列的引物序列，其特征是该引物序列具有如SEQID NO 3所示的核苷酸序列，且具有SmaI酶切位点；
11.一种来自Bt-E.coli的穿梭表达载体，其特征是该穿梭表达载体是由权利要求1的基因序列、一个来自E.coli的表达载体、一个来自Bt-E.coli的穿梭载体和一个来自Btcry3Aa7基因的强启动子Pcry3Aa7所构建；
12.一种苏云金芽孢杆菌基因工程菌，其特征是该基因工程菌是通过使用权利要求11的穿梭表达载体转化细胞而得到，且对昆虫具有高毒力；
13.权利要求12的基因工程菌，其中所说的细胞是Bt细胞；
14.权利要求12的基因工程菌，其中所说的昆虫是鳞翅目昆虫；
15.一种基因cry1Ie1与cry1Ab13的组合，其特征是该组合可应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生；
16.一种蛋白质Cry1Ie1和Cry1Ab13的组合，其特征是该组合可应用于转化微生物和植，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。
全文摘要
本发明为“苏云金芽孢杆菌cryl基因、基因组合及表达载体”，属生物防治技术领域。进一步，本发明涉及对鳞翅目害虫高毒力的Bt crylle基因的核苷酸序列和其编码的蛋白质的氨基酸序列，涉及协同组合使用crylle基因与crylAb、crylBa等基因表达产物，还涉及表达上述基因序列的引物序列和本发明构建的广宿主穿梭表达载体pSXY422b。通过使用上述基因或其组合，可使它们对鳞翅目害虫的毒力高于出发菌株和单基因表达产物，扩大它们对鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫的杀虫谱，并通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。
文档编号C12N1/21GK1401772SQ0112416
公开日2003年3月12日 申请日期2001年8月20日 优先权日2001年8月20日
发明者宋福平, 张 杰, 黄大昉, 陈中义, 潘映红 申请人:中国农业科学院植物保护研究所