专利名称：复合载体的多环芳烃降解菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及多环芳烃污染土壤的微生物修复，具体的说是一种去除多环芳烃的菌剂的制备及其应用。
背景技术：
随着工业化进程的加速，有毒有害物质释放到土壤环境中的量远远超过其自净能力，其中常见的一类持久性有机污染物-多环芳烃(PAHs)，其污染浓度已从ug/kg量级升至 mg/kg量级，检出率从不到20%增至80%以上。多环芳烃(PAHs)是指2个或2个以上的苯环稠合在一起的芳香化合物，主要是高温下有机物不完全燃烧所致，且大多具有“三致”效应。多环芳烃辛醇-水分配系数高，易通过食物链等生物放大途径最终威胁人类健康和生态安全，因此，近年来多环芳烃污染修复备受关注。多环芳烃在环境中可通过多种途径得以降解或消除，包括挥发、光氧化、化学氧化、生物富集、土壤吸附及微生物降解等，其中微生物在环境中PAHs的迁移、转化及降解过程中占有重要的地位。目前分离得到的多环芳烃高效降解菌主要有=Sphingomonas (鞘氨醇单孢菌属)、Pseudomonas (假单孢菌属)、Mycobacterium (分枝杆菌属)、 Iihodococcus (红球菌属)等，其降解多环芳烃主要以(1)以PAHs为唯一碳源和能源；(2) 将PAHs与其他有机质进行共代谢这两种方式进行。事实上，多环芳烃降解菌在实际修复应用过程中会受到环境介质中其他因素如新环境的适应性(PH、温度、湿度等差异)、基质营养不足、与介质中其他微生物竞争等影响从而未发挥预期修复效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以有效降低污染环境中高环多环芳烃含量的复合载体的多环芳烃降解菌剂及其制备方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种复合载体的多环芳烃降解菌剂，由 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-1 菌悬液禾口载体组成，Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌悬液与载体的体积/质量比为每20 50ml的Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌悬液中加入15g的载体；每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌悬液中含有 5. O 6. 0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-1菌体；载体由黑炭和腐殖质组成，黑炭和腐殖质的质量比为1. 8 2. 2 1。作为本发明的复合载体的多环芳烃降解菌剂的改进腐殖质为森林土壤剖面的0层。本发明还同时提供了上述复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，包括如下步骤1)、菌悬液的制备禾Ij M Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 白勺 I 胃胃 ^ Mycobacterium
3vanbaalenii. PYR-I^ml 白勺 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I巾L
5. 0 6. 0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌体；2)、载体原料的准备黑炭用0. 005 0. 015mol/L的HCL调节至中性，干燥(干燥至恒重后待用)；腐殖质用0. 005 0. 01mol/L的NaOH调节至中性，干燥(干燥至恒重后待用)；3)、将步骤2)所得的黑炭和步骤2)所得的腐殖质按照1. 8 2. 2 1的质量比混合后，得载体；先将所述载体灭菌(为常规的高压蒸汽灭菌)，然后加入步骤1)所得的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌悬液，每 15g 的载体中力口入 20 50ml 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌悬液，再加入30 50ml的无菌水；均勻混合后冷冻干燥，得复合载体的多环芳烃降解菌剂。作为本发明的复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法的改进，步骤1)为挑取Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I的单菌落接种于装有LB培养基的三角瓶中，于30°C，120rpm避光水浴振荡培养22 沈小时；然后调节至每ml的MyccAacterium vanbaalenii. PYR-I 菌悬液中含有 5. 0 6. 0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌体。作为本发明的复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法的进一步改进步骤3) 中的冷冻干燥为于-56 -50°C干燥6 8h。作为本发明的复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法的进一步改进LB培养液的制备方法如下在每升水中加入酵母提取物5g、蛋白胨IOg和Nacl 5g，然后用NaOH调 PH 7. 4 7. 6。作为本发明的复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法的进一步改进将步骤 2)所得的黑炭和步骤幻所得的腐殖质按照2 1的质量比混合后，得载体。在本发明中，使用无菌水的目的是使载体处于悬浮状态，方便菌悬液与载体充分混勻。本发明以菌株 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 的富集液(艮Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌悬液)为有效成份，将其吸附于黑炭和腐殖质制成的颗粒载体上，冷冻干燥后制成固体颗粒状分装成袋，即为复合载体的多环芳烃降解菌剂。该多环芳烃降解菌剂无菌装袋封口，可常温干燥保存。在本发明中，菌Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I,即为分支杆菌PYR-1,分类命名为MyccAacterium varAaalenii，菌株编号为PYR-1，可购于德国的微生物菌种保藏中心公司(详见www.dsmz.de)。黑炭，购买自海诺炭业，为100目干粉；腐殖质为森林土壤剖面
的0层，呈黑褐色。在本发明中，可利用控制0D600值来调节每ml的Mycobacterium vanbaalenii. PTO-I菌悬液中含有的Mycobacterium vanbaalenii. PTO-1菌体的量。例如当调节0D600 =0. 6左右，该菌悬液含有约为5. 3*108CFU的菌体。在本发明中，多环芳烃为辛醇水分配系数较高的四环的芘。本发明的原理如下本发明以黑炭与腐殖质按照特定的质量比混合作为载体材料，采用吸附固定方
4法，对培养驯化的高效降解菌进行固定化，制备成菌剂。本发明所用载体材料之一黑炭，自然界广泛存在，环境异质性小，理化性质较稳定，其最大特征是比表面积大，主要因其由堆叠的芳香片组成的三维结构、颗粒大小从nm到um不等。可作为微生物栖息的“场所”，为微生物营造相对稳定的生存环境。载体材料之二腐殖质一方面以补充微生物适应期生长所需营养物质，另一方面其有效组成成分可以不同程度上提高多环芳烃的表观溶解度。菌株在此载体中生长，可有效缓减游离菌株在新环境中进行正常新陈代谢的胁迫压力，该菌剂的使用可提高微生物存活率及耐受性，从而达到多环芳烃修复效果。本发明具有如下优点1、成本低、环境异质性小。本发明利用廉价且自然界广泛存在的黑炭和腐殖质为载体制成产品，价格低廉，来源广泛，且均为自然界广泛存在的物质故环境异质性小，不产生二次污染。2、应用效果好。本发明采用黑炭和腐殖质作为载体吸附固定微生物，对菌株吸附速度快、增殖效果好。将本发明制备的菌剂按照投放到多环芳烃污染介质中，6d后其降解率可达95%以上。3、菌株保存时间长、活性高。以黑炭和腐殖质作为菌剂载体，其营造的微环境可使菌株长期保持活性，同时可强化菌株的降解能力。综上所述，本发明将黑炭、腐殖质和菌种以一定比例混合制成菌剂，以提高微生物的存活率及耐受性，从而达到多环芳烃修复的效果。本发明的实际用法和用量如下在水中加入复合载体的多环芳烃降解菌剂制成悬浊液，每L悬浊液中含有0. 5 IOg多环芳烃菌剂，然后喷洒于土壤上，按土壤中多环芳烃浓度IOppm计，每亩土壤中多环芳烃降解菌剂的用量为2 ^g。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是本发明在液体环境下菌剂修复多环芳烃效果图。
具体实施例方式实施例1、一种复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，依次进行如下步骤1)、菌悬液的制备将Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I的单菌落接种于装有LB培养基的三角瓶中，于30°C，120rpm避光水浴振荡培养Mh。得菌悬液。将上述菌悬液调至0D600 = 0. 6 左右，即每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌悬液中含有 5. 3*IO8CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌体。LB培养液的制备方法如下在每升水中加入酵母提取物(酵母膏)5g、蛋白胨IOg 和Nacl 5g，用NaOH调PH 7. 4 7. 6，然后经常规的高压灭菌而得。2)、载体原料的准备黑炭(为100目)用0. 005 0. 01mol/L的HCL调至中性，自然风干至恒重后待用；腐殖质可选用森林土壤剖面的0层，呈黑褐色，用0. 005 0. 01mol/L的NaOH调
5至中性，自然风干至恒重后待用。3)、称取IOg步骤2、所得的黑炭和5g步骤2、所得的腐殖质按照混合后，得15g 载体；先将上述载体进行常规的高压湿气灭菌3次，每次灭菌时间为30分钟；然后加入30ml 步骤 1)所得的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌悬液，再加入40ml无菌水；均勻混合后于_53°C干燥几，得约15g复合载体的多环芳烃降解菌剂。所得的复合载体的多环芳烃降解菌剂无菌装袋封口，常温干燥保存，保存期一般为1 3年。应用例1(1)将0. 05克芘溶于IOOml丙酮，配制成500ppm芘的母液，将芘的母液Iml添加到IOml矿质培养液中，使芘的最终浓度50ppm。置于超净工作台过夜，待丙酮挥发尽。上述矿质培养基配方为每升水中含K2HPO4 4g、Na2HPO4 4g、(NH4)2SO4 2g、 MgSO4. 7H20 0.2g、CaCl2 lmg、FeSO4. 7H20 lmg，调pH至中性；然后经常规的高压灭菌而得。(2)称取0. Ig菌剂(即实施例1所得的多环芳烃降解菌剂)至上述含有50ppm芘的矿质培养基IOml中，30°C，120rpm避光水浴振荡培养，于第0、3、6d采样上GC-MS测定芘的残留浓度。以同样的方法做空白(CK)试验，即不添加菌剂。当液体环境下芘的浓度为50ppm时，经过6d处理，添加菌剂处理其浓度降为 0. 98mg/kg,降解率达到98. 04%。在同样的时间内，CK中芘的浓度保持在50mg/kg左右，未见明显的下降趋势。实验结果说明本发明的菌剂对液体环境下高环多环芳烃的修复效果非常好且修复速度快。一般认为多环芳烃降解菌只利用溶液中的污染物，本发明采用的液体矿质培养基含有50mg/kg芘，已远远超过芘的溶解度，对降解菌会产生不同程度的毒害作用，但是本发明的菌剂6d内对芘的降解率达98%以上，说明该菌剂可有效缓减多环芳烃对降解菌的毒害作用，为菌株增殖并进行正常新陈代谢提供良好的场所，同时可强化菌株的降解能力。对比例1、将上述应用例1中的0. Ig菌剂改成0. 2ml的实施例1的步骤1)所得的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌悬液(艮口每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌悬液中含有 5. 3*IO8CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌体)，即，保证 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌体有效用量一致。其余均等同。结果为当液体环境下芘的浓度为50ppm时，经过6d处理，添加菌悬液的处理其浓度降为27. 6ppm,降解率为44. 8%，如图1。与应用例1中本发明菌剂的降解效果相比，本发明的菌剂效果明显高于单纯使用菌液的情况，说明本发明的菌剂更具有降解多环芳烃的优势，可用于实践。对比例2、取消实施例1中腐殖质的使用，即，步骤3)中的15g载体全部由15g步骤2)所得的黑炭组成；其余同实施例1。所得的称为多环芳烃降解菌剂I。将上述应用例1中的0. Ig菌剂(实施例1所得)改成0. Ig的上述多环芳烃降解菌剂I，即,保证Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌体有效用量一致。其余均等同。结果为当液体环境下芘的浓度为50ppm时，经过6d处理，添加菌悬液的处理其浓度降为8. Ippm,降解率为83. 8%。说明选用黑炭和腐殖质组成的载体所制成的菌剂优于单纯选用黑炭作为载体所制成的菌剂。
6
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.复合载体的多环芳烃降解菌剂，其特征是由MyccAacteriumvanbaalenii. PYR-I 菌悬液和载体组成，所述MyccAacterium vanbaalenii. PYR-I菌悬液与载体的体积/质量比为每20 50ml的Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌悬液中力口入15g的载体；所述每 ml 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌悬液中含有 5. 0 6. 0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌体；所述载体由黑炭和腐殖质组成，所述黑炭和腐殖质的质量比为1.8 2. 2 1。
2.根据权利要求1所述的复合载体的多环芳烃降解菌剂，其特征是所述腐殖质为森林土壤剖面的0层。
3.如权利要求1或2所述的复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，其特征是包括如下步骤1)、菌悬液的制备利用Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 的单菌落制备Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌悬液，所述每ml的Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌悬液中含有5. 0 6. 0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I 菌体；2)、载体原料的准备黑炭用0. 005 0. 015mol/L的HCL调节至中性，干燥；腐殖质用0. 005 0. 01mol/L的NaOH调节至中性，干燥；3)、将步骤2)所得的黑炭和步骤2)所得的腐殖质按照1.8 2. 2 1的质量比混合后，得载体；先将所述载体灭菌，然后加入步骤1)所得的MyccAacterium varAaalenii. PYR-I菌悬液，每15g的载体中力口入20 50ml的Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌悬液，再力口入 30 50ml的无菌水；均勻混合后冷冻干燥，得复合载体的多环芳烃降解菌剂。
4.根据权利要求3所述的复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，其特征是所述步骤1)为挑取Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I的单菌落接种于装有LB培养基的三角瓶中，于30°C，120rpm避光水浴振荡培养22 沈小时；然后调节至每ml的MyccAacterium vanbaalenii. PYR-I 菌悬液中含有 5. 0 6. 0*108CFU 的 Mycobacterium vanbaalenii. PYR-I菌体。
5.根据权利要求4所述的复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，其特征是所述步骤3)中的冷冻干燥为于-56 _50°C干燥6 8h。
6.根据权利要求5所述的复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，其特征是所述 LB培养液的制备方法如下在每升水中加入酵母提取物5g、蛋白胨IOg和Nacl 5g，然后用 NaOHi周 PH 7. 4 7. 6。
7.根据权利要求6所述的复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，其特征是将步骤2)所得的黑炭和步骤幻所得的腐殖质按照2 1的质量比混合后，得载体。
全文摘要
本发明公开了一种复合载体的多环芳烃降解菌剂，其由Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液和载体组成，菌悬液与载体的体积/质量比为每20～50ml的菌悬液中加入15g的载体；每ml的菌悬液中含有5.0～6.0×108CFU的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌体；载体由黑炭和腐殖质组成，黑炭和腐殖质的质量比为1.8～2.2∶1。本发明还同时公开了上述复合载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法。本发明的产物能有效降低污染环境中高环多环芳烃的含量。
文档编号A62D3/02GK102392012SQ20111022494
公开日2012年3月28日 申请日期2011年8月8日 优先权日2011年8月8日
发明者何艳, 徐建明, 徐民民, 王娇娇, 马斌 申请人:浙江大学