专利名称：重排噬菌体e基因、含有该基因的打孔质粒载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种经基因重排后获得的DNA，尤其涉及一种经基因重排后 获得的PhiX174噬菌体mE基因的DNA，本发明还涉及含有该DNA的打孔质粒 载体及其构建方法，本发明还进一步涉及该孔质粒载体在制备菌蜕中的用途, 属于基因工程领域。
背景技术：
细菌菌蜕(Bacterial Ghost)是一种没有细胞浆和核酸的空细菌体。将 PhiX174噬菌体E裂解基因在细菌中表达，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和 胞壁上可形成穿膜隧道，在渗透压的作用下使菌体破裂，细菌胞内细胞浆和 核酸成分通过此隧道被排出，形成一种空的细菌外壳，即为"Bacterial Ghost"。 bacterial ghost是由内膜(cytoplasmic membrane),胞浆间隙(periplasmic space) 和外膜(outer membrane)组成，因此细胞壁在很大程度上被完整保存下来。在 有些菌株的外膜上还有一层S—layer，也成为bacterial ghost的成分之一。 Bacterial Ghost本身可作为一种很好的疫苗，因为它保留了和活菌一样的细菌 胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫细胞通过模式识别受体识 别的高度保守结构PAMP(pathogen-associated molecular patterns),例如脂多糖， 肽聚糖，CPG， OmpA和菌毛等，能有效地被DC和巨噬细胞所吞噬。目前， ghost通过静脉、皮下、气体等途径免疫已经在小鼠、兔子、猪等动物模型中取得了良好的免疫保护效果。用A ; /e"rap"e,om^ ghosts气体免疫接种猪， 诱导了针对^p/e"ra/ww/wo"^引起的胸膜肺炎的完全保护。霍乱菌 ghost(VCG)经皮下注射小鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱特异性IgG抗体。 同时显示，针对VCG的抗体足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。另外， Bacterial Ghost还可以用作一种极好的递送系统，通过在细菌裂解之前对细菌 进行外膜的人工改造，将外来抗原，核酸或药物等其它成分锚定于胞膜的内、 外侧，或充于胞浆周质。这样制备的重组ghost拥有完好的，天然的细菌外膜 结构，能同时激发体液和细胞免疫应答。其菌毛等表面黏附结构，又使之能 靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道和呼吸道的黏膜表面，进而较易被机体 吞噬细胞，如PP结(Peyer， s Patches)的M细胞所识别捕获，故而可有效递送 疫苗抗原至黏膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。Eko等人将沙眼衣原体 (C.frac/zomafe)抗原在霍乱菌的内膜表达，然后裂解制备的重组ghost(VCG)有 效地激发了生殖道黏膜的Thl型免疫应答，现在正在着手进入临床实验。与 传统的原核系统表达蛋白相比，重组bacterial ghost有几大优势(l)重组蛋白 被整合在一个具有高度免疫原性的环境中；(2)对蛋白的大小要求范围宽泛， 但蛋白的分子量最好在2000到200，000Da之间；(3)重组蛋白被直接表达后整 合到细菌的膜上，裂解后就能直接用于免疫动物，而不必要象以前制备免疫 原时要先分离纯化重组蛋白；(4)整合在细胞壁的重组蛋白是以天然的构象， 所以保持了它原有的活性形式。而一般基因重组的蛋白通过原核系统大都以 包涵体的形式表达，只能通过变性、复性的方法在一定程度上恢复蛋白活性。 (5)ghost的制备相对简单，可用发酵技术获得，而不需进行复杂的纯化工作； 可以冻干的形式贮存于室温。
溶解基因E的表达可在入pL/pR-c1857或在lacPO-lacIq启动阻遏系统的转录控制下完成。
一些含有不同抗性标记、复制起始区和基因E表达控制的特
异性溶解质粒已经被构建出来。入pR启动子和温敏阻遏物cl857在30°C以 下能抑制基因E的表达，高于30°C会导致阻遏物cl857热灭活而诱导E基因 表达。为了制备ghost，细菌须在28。C条件下生长到对数生长期，然后升温 到42。C诱导其溶解。
E蛋白介导的溶解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌 和肠炎沙门氏菌等多种细菌，范围如此之大说明了只要E溶解盒被引入到适 当的载体中，E蛋白介导的溶解可能会在每个革兰氏阴性菌中发生。
目前，国外在大肠杆菌等的ghost制备方面己有很多成功的先例。在这些 研究中，包括使用单启动子和双启动子的策略，使穿孔质粒的打孔效率得到 一定程度的提高，但仍未达到实际应用的要求。有资料显示，原来为高拷贝 的穿孔质粒，当连接入E基因后，穿孔质粒的拷贝数明显减少，变为低拷贝 数质粒，由此也造成了打孔效率的降低。因此，除去启动子等的因素外，参 与打孔的E基因将是重点研究的对象，但这方面并未见相关研究报道。
发明内容
本发明目的之一是提供一种将PhiX174噬菌体E基因重排后获得的mE基
因；
本发明目的之二是提供一种分离和克隆上述噬菌体mE基因的方法； 本发明目的之三是提供一种含有上述噬菌体mE基因的打孔质粒载体； 本发明目的之四是提供一种构建上述噬菌体mE基因的打孔质粒载体的方法。
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的一种经基因重排后获得的PhiX174噬菌体mE基因，该基因的核苷酸序列 为SEQ ID N0:1所示。
一种分离和克隆上述PhiX174噬菌体mE基因的方法，包括以下步骤
(1) 以噬菌体PhiX174双链DNA为模板，以SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3 所示的碱基序列为引物进行PCR扩增，得到噬菌体溶菌基因E;
(2) 将步骤(1)扩增得到的噬菌体溶菌E基因用DNA酶进行酶切，回 收10-50bp的酶切DNA片段；
(3) 以步骤(2)所回收的10-50bp酶切DNA片段为模板和引物进行PCR 扩增，获得小于276bp的扩增产物；
(4) 以SEQIDN0.2和SEQIDN0.3所示的碱基序列为引物，以步骤(3) 所得到的PCR产物为模板进行PCR扩增，获得基因重排后的E基因，即mE基 因。
将本发明噬菌体mE基因与pBV220、 pMuH36、 pGEX—6P—l或pBBR-MCS 等载体可操作性的相连接，即可得到打孔质粒载体；作为本发明的一个优选 的技术方案，将本发明噬菌体mE基因与pBV220可操作性的相连接，得到打 孔质粒载体pBV-mE，该打孔质粒载体pBV-mE可有效将大肠杆菌裂解。
具体的， 一种构建打孔质粒载体pBV-mE的方法，包括
将噬菌体mE基因纯化后用T4 DNA连接酶与经￡coR I和Ba/nH I双酶切消 化的pBV220载体相连接，即得。
一种应用上述打孔质粒载体pBV-mE制备大肠杆菌菌蜕的方法，包括在 含氨苄青霉素的LB中接种含打孔质粒载体pBV-E的大肠杆菌，37'C过夜震荡 培养，然后转接于含氨苄青霉素的LB中，28-C震荡培养至0De。^达0.4-1.0; 将培养物迅速调高到42'C培养以诱导E基因表达，继续培养3-5小时；溶菌结束后形成的ghost菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存。
本发明的再一个目的是探寻打孔质粒载体pBV-mE打孔效果与mE基因变 异的相关性通过对选取不同菌落的28'C过夜震荡培养(220 r/min)和42 'C培养以诱导mE基因表达，肉眼观察打孔效率，可以观察到不同的打孔结果， 即打孔效率高呈现清澈透明的菌液，打孔效率低或不打孔呈现混浊菌液。 将打孔效率高的和低的或不打孔的重组菌分别进行质粒提取和mE基因的核苷 酸序列测定，分析比较不同打孔效果重组质粒的mE基因的变异情况，从中获 得mE基因的变异与打孔效率的相关性，结果表明，以本发明噬菌体mE基因所 构建的打孔质粒pBV-mE的打孔效果最为显著，远远超过了而其他形式的突变 基因所构建的打孔质粒的打孔效率，由这些突变基因所构建的打孔质粒的打 孔效率很低或根本没有打孔效果。
本发明利用基因重排技术，对PhiX174噬菌体E基因进行重排，通过缺 失第1位起始密码子ATG的A，使阅读框架为276个核苷酸的E突变成阅读 框架为201个核苷酸的mE (从第76位ATG)。将所制备的mE基因与pBV220 载体可操作性的相连接得到打孔载体pBV-mE，该打孔载体pBV-mE能够有效提 高对细菌的打孔效率，裂解效率可高达99.9613%,比现有打孔质粒载体在同 株大肠杆菌的裂解效率高出了 3个数量级。
图l本发明采用基因重排技术获得突变后的mE基因的线路图。 图2本发明大肠杆菌打孔质粒载体pBV-mE的构建示意图。 图3大肠杆菌Ghost (菌蜕)的肉眼观察结果。 图4大肠杆菌Ghost (菌蜕)的透射电镜观察结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随 着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成 任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下 可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均 落入本发明的保护范围内。
试验材料
菌株及质粒大肠杆菌TG1以及为本研究室自藏；噬菌体PhiX174购于
Promega (北京)生物技术有限公司。质粒pBV220的构建过程可按照以下文 献构建张智清，姚立红，侯云德，含PrPl启动子的原核高效表达载体的组 建及其应用，病毒学报，1990， 6 (2)， 111 — 116。
实施例1PhiX174溶菌基因E (inE)的分离和克隆
根据GenBank中噬菌体PhiX174溶菌基因E的编码序列设计引物 Lysis E-U: 5， — AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG -3， (SEQ ID NO. 2) Lysis E-L: 5，- AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG -3， (SEQ ID NO. 3) 上、下游引物5'端分别引入了限制性酶切位点fcoR I和5a/nH I，由上 海生工合成。以噬菌体PhiX174双链DNA为模板扩增溶菌基因E: PCR扩增反 应体系为50 yL，其中MgS04 2 mM，上、下游引物各1 u M， dNTP 200 P M， 10x Tag buffer, Tag DNA聚合酶2 U (TaKaRa)，模板DNA10 ng。 PCR反应 程序为95°C预变性5 min， 94°C 30 s， 59°C 30 s， 72°C 30 s， 30个循 环，72°C 5min。 PCR扩增后的E基因经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，然后用DNA酶对E基因进行酶切，回收10-50bp的DNA片段。取1 u L回收后的 DNA为模板和引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为50 uL:10x r叫buffer, Tag DNA聚合酶2 U (TaKaRa)，模板DNA10 ng。 PCR反应程序为95°C预 变性5 min， 94°C 30 s， 42°C 30 s， 72°C 30 s， 30个循环，72°C 5 min。 电泳结果为小于276bp的Smear。
以特异性引物Lysis E-U (SEQ ID NO. 2)和Lysis E_L (SEQ ID NO. 3) 对以上述PCR产物进行特异性扩增。PCR扩增反应体系为50 uL，其中MgS04 2 mM，上、下游引物各l uM， dNTP 200 u M， 10x Tag buffer, Tag DNA聚 合酶2 U (TaKaRa)，模板luL。 PCR反应程序为95°C预变性5 min， 94°C 30 s， 59°C 30 s， 72°C 30 s, 30个循环，72°C 5 min。获得基因重排后的 E基因，即mE基因，用胶回收试剂盒回收。
实施例2打孔质粒载体pBV-mE的构建
将实施例1所克隆的溶菌基因mE纯化后用EcoR iABa/n H I进行双酶切， 用T4 DNA连接酶(TaKaRa)与经￡coR I禾n fe/n H I双酶切消化的pBV220载 体相连接，16T:过夜连接并热激转化入大肠杆菌TG1感受态细胞，经菌落PCR 鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，命名为pBV-mE。
实验例1未重排的噬菌体溶菌基因E与重排的噬菌体溶菌基因mE所构建的打 孔质粒载体的打孔效率比较实验 1、实验材料 (1 )、实施例2所构建的打孔质粒载体pBV-mE;
(2)、将未重排的噬菌体溶菌E基因按照实施例2的方法构建得到打孔质粒载体pBV-E;
2、 实验方法
选取10个(1 一 10号)含打孔质粒载体pBV-E和pBV-mE的大肠杆菌TGI 的菌落，分别接种在5 mL含50 li g/mL氨苄青霉素的LB中，28。C过夜震荡培 养(220 r/min)，然后转接1-2 mL于50mL含50 P g/mL氨节青霉素的LB中， 28'C震荡培养至0D6i达0.4、 0.6、 0.8、 1.0。取出100ul培养物备用，将 剩余培养物迅速调高到42'C培养以诱导mE基因表达，继续培养3-5小时，肉 眼观察打孔效率。
3、 实验结果
当OD值在0.4—0.6时，打孔质粒pBV-E和pBV-mE均可有效打孔，表现 为清澈透明的菌液，但以pBV-mE的打孔效率高。
当OD值在0. 6_1. 0时，pBV-E并未观察到明显的打孔效果，与对照组无 差别，表现为菌液均匀混浊，无菌液透明和沉淀现象出现。而pBV-mE打孔质 粒除了表现为菌液透明之外，还表现为明显的沉淀现象，打孔效率远高于 pBV-E，打孔效率达到90%，超过pBV-E至少3个数量级。
将打孔质粒载体pBV-mE制备大肠杆菌Ghost (菌蜕)，裂解效率可高达 99.9613%，比打孔质粒载体pBV-E在同株大肠杆菌的裂解效率高出了 3个数 量级。
实验例2大肠杆菌Ghost (菌蜕)的制备
在5 mL含50 li g/mL氨苄青霉素的LB中接种含打孔质粒载体pBV-mE的 大肠杆菌TG1， 28。C过夜震荡培养(220 r/min)，然后转接1-2 mL于50mL含 50 u g/mL氨苄青霉素的LB中，28'C震荡培养至006。。> 达0. 4左右。取出100 u 1培养物备用，将剩余培养物迅速调高到42'C培养以诱导mE基因表达，继续培 养3-5小时；取诱导前后的培养物各100 u 1适当稀释后涂LB平板进行活菌 CFU检测。溶菌结束后形成的ghost菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存，并对冻 干后的菌蜕进行活菌CFU检测。所制备的菌蜕的肉眼观察结果见图3。
试验结果溶菌前后的培养物从2. lxl()8下降到1. 0x104 (CFU/ml)，溶菌 灭活效率达99. 9613%。
实验例3大肠杆菌Ghost (菌蜕)的透射电镜观察
将实验例2中在42°C中培养3-5小时的菌液4 000 g离心10min，以2. 5 %戌二醛固定细菌，置4。C下2h， 0. Olmol/L PBS洗涤3次，离心后经四氧化 锇再固定、乙醇逐级脱水、包埋剂包埋等步骤处理后进行电镜观察。菌蜕的 透射电镜观察结果见图4。序列表
<110〉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120〉重排噬菌体E基因、含有该基因的打孔质粒载体及其应用
<130〉PKL0768
<160>3
〈170〉Patentln version 3. 5
<210〉 <211> <212〉 <213>201 DNA phage E
<400> 1 atgttcatcc cgtcaacatt caaacggcct gtctcatcat ggaaggcgct gaatttacgg60
aaaacattat taatggcgtc gagcgtccgg ttaaagccgc tgaattgttc gcgtttacct120
tgcgtgtacg cgcaggaaac actgacgttc ttactgacgc agaagaaaac gtgcgtc犯a180
aattEtcgtgc ggaaggagtg a201
<210> <211〉 <212〉 <213>2 30 DNA phage E
<400>' 2 agggaattca tggtacgctg gactttgtgg30
<210> <211> <212> <213〉3 27 腿 phage E
<400〉3
aggggatccg agctctcact ccttccg 2权利要求
1、重排噬菌体E(phage E)基因，其特征在于其碱基序列为SEQ ID NO1所示。
2、 一种分离和克隆权利要求1所述重排噬菌体E (phage E)基因的方法， 包括以下步骤(1) 以噬菌体PhiX174双链DNA为模板，以SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3 所示的碱基序列为引物进行PCR扩增，得到噬菌体溶菌基因E;(2) 将步骤(1)扩增得到的噬菌体溶菌E基因用DNA酶进行酶切，回 收10-50bp的酶切DNA片段；(3) 以步骤(2)回收的10-50bp的酶切DNA片段为模板和引物进行PCR 扩增，获得小于276bp的扩增产物；(4) 以SEQIDN0.2和SEQIDN0. 3所示的碱基序列为引物，以步骤(3) 所得到的PCR产物为模板进行PCR扩增，即得。
3、 含有权利要求1所述重排噬菌体E (phage E)基因的表达载体。
4、 按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是大 肠杆菌打孔质粒载体pBV-mE。
5、 一种构建权利要求4所述打孔质粒载体pBV-mE的方法，包括将权 利要求1所述的重排噬菌体E基因纯化后用T4DNA连接酶与经EcoR I和Sa/nH I双酶切消化的pBV220载体可操作性的相连接，即得。
6、 含有权利要求3或4所述表达载体的细胞系。
7、 按照权利要求6所述的细胞系，其特征在于其为大肠杆菌细胞系。
8、 权利要求4所述的大肠杆菌打孔质粒载体pBV-mE在制备大肠杆菌菌 蜕中的应用，包括在含氨苄青霉素的LB中接种含打孔质粒载体pBV-E的大肠杆菌，37'C过夜震荡培养，然后转接于含氨苄青霉素的LB中，28'C震荡培 养至0D6^达0.4-1.0;将培养物迅速调高到42。C培养以诱导E基因表达，继 续培养3-5小时；溶菌结束后形成的ghost菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存。
全文摘要
本发明公开了一种经基因重排后获得的PhiX174噬菌体mE基因以及含有该基因的打孔质粒载体及其构建方法，本发明还进一步涉及该孔质粒载体在制备菌蜕中的用途，属于基因工程领域。本发明利用基因重排技术，对PhiX174噬菌体E基因进行重排，通过缺失第1位起始密码子ATG的A，使阅读框架为276个核苷酸的E突变成阅读框架为201个核苷酸的mE(从第76位ATG)。将所制备的mE基因与pBV220载体可操作性的相连接得到打孔载体pBV-mE，该打孔载体pBV-mE能够有效提高对细菌的打孔效率，裂解效率可高达99.9613％，比现有打孔质粒载体在同株大肠杆菌的裂解效率高出了3个数量级。
文档编号C12N15/63GK101302527SQ20081011109
公开日2008年11月12日 申请日期2008年6月13日 优先权日2008年6月13日
发明者刘思国, 刘慧芳, 薇 司, 常月红, 伟 彭, 王春来 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所