玉米丝氨酸消旋酶基因作为筛选标记在南抗杨转化体系中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织培养技术和植物基因工程领域，提供了一种玉米丝氨酸消旋酶基 因作为筛选标记在南抗杨遗传转化中的应用。
【背景技术】
[0002] 杨树，是全世界上栽培面积最大、木材产量最高，同时也是对碳固定贡献最大的树 种。杨树作为林业研宄中的模式植物，具有优良的实验特性，容易进行种间杂交和无性繁 殖；已建立完善遗传转化系统并且生长迅速；除此之外，杨属植物具有丰富的遗传多样性。 采用常规育种方法改良林木，不仅抗性周期长、工序复杂、费时费工，而且容易受到气候、地 域和水分等的影响，基因工程的发展为杨树新品种的培育开辟了一条经济且有效的途径。
[0003] 植物的遗传转化研宄主要是通过将具有优良性状的外源目的基因导入到植物基 因组中，用标记基因筛选出真正含有目的基因片段的转化体，并使其完整再生，通过这种方 式获得遗传性状改良的转化植株。其中标记基因可以在遗传转化中筛选和鉴定出转化的植 物细胞、植物组织和转基因植株，起到区分转化和非转化细胞的关键作用。根据筛选方法的 不同可分为选择基因（Selectivegene)和报告基因（reportergene)。选择基因通常是 指抗生素和除草剂抗性基因，而报告基因有葡萄糖苷酸酶基因（GUS)、荧光素酶基因（LUC) 和绿色荧光蛋白基因（GFP)等。出于对生态环境以及转基因食品的生物安全性等方面的考 虑，标记基因又可分为传统的选择标记基因（traditionalselectivemarkergene)和生 物安全性标记基因（biosafetymarkergene)。随着科研方面开展更多的在田间的转基因 植物实验，以及在消费市场中逐步投放的转基因产品，使得社会越来越关注转基因生物安 全性问题，相关科学工作者对这个问题也引起了高度的重视，因此对于开展生物安全性标 记基因的研宄有其必然性以及极其重要的意义。
[0004] 玉米丝氨酸消旋酶（serineracemase，SR)是一类依赖PLP型酶，同时具有消旋酶 和脱水酶的两种活性。SR的酶活反应需要金属离子，哺乳动物SR还需要ATP的参与，植物 SR则不需要ATP的参与。不仅能将L-/D-丝氨酸转化成相应的D-/L-丝氨酸；而且可以将 L-/D-丝氨酸转化成丙酮酸。之前的一些学者一直认为动植物体内的氨基酸不存在D-型氨 基酸，都是以L-型氨基酸存在的。自从在细菌的细胞壁中发现了D-丙氨酸和D-谷氨酸后， 人们开始研宄微生物中的氨基酸消旋酶。之后从水稻、大麦、拟南芥等物种中分离纯化出丝 氨酸消旋酶，并进一步的研宄了该酶的性质。丝氨酸消旋酶作为一种无抗性选择标记基因， 对于植物中的D-丝氨酸具有解毒的功能，并且对于生态环境不会造成污染，是一种安全的 筛选标记基因。因此研宄该标记基因能否能在木本植物中高效表达，具有重要的科学意义 和应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种玉米丝氨酸消旋酶基因及其表达载体，以及该基因作为 筛选标记在南抗杨遗传转化中的应用。本发明所提供的玉米丝氨酸消旋酶基因为ZmSR，其 来源于玉米属玉米（ZeamaysL.)，该基因片段大小为1014bp。
[0006] 本发明所涉及的设计方案为一种玉米丝氨酸消旋酶基因，具有序列表中SEDID NO:l项下的序列。ZmSR通过B73自交系三叶期cDNA为模板克隆获得，经过测序其为 1014bp，与NCBI网站公布的玉米丝氨酸消旋酶基因（NM_001143028. 1)序列一致。
[0007] 本发明还提供了一种玉米丝氨酸消旋酶基因表达的载体，其特征在于能作为筛选 标记在南抗杨遗传转化中的应用。利用前述的玉米丝氨酸消旋酶基因将替换双元表达载体 PCAMBIA1301上的⑶S标记基因，将该载体命名为pBI1301-ZmSR。以南抗杨组培苗的叶片为 对象，通过农杆菌介导的遗传转化，将pBI1301-ZmSR载体导入到南抗杨。先对南抗杨的叶 片和不定芽分别进行D-丝氨酸的敏感性试验，确定各自的筛选的临界浓度分别为15mM和 12. 5mM。再以南抗杨组培苗的叶片为材料，通过农杆菌介导法将pBI1301-ZmSR导入到叶片 以及愈伤组织进行遗传转化，并以含有⑶S基因的pBI121转化南抗杨的叶片以及愈伤组织 作为对照，对比试验发现转⑶S基因的南抗杨叶片以及愈伤组织比转pBI1301-ZmSR分化率 高，但转pBI1301-ZmSR的污染率较转含有⑶S基因的pBI121的污染率低从而获得转基因 南抗杨植株。筛选转化植株，最后共获得12株D-丝氨酸抗性苗，经分子检测共有3株植。 对转基因植株的表型性状进行观察，非转基因植株作为对照，结果表明转pBI1301-ZmSR的 叶片生长状况优于非转基因和转含有⑶S基因的pBI121的南抗杨，且转pBI1301-ZmSR的 南抗杨株高明显高于转含有⑶S基因的pBI121的南抗杨。
[0008] 在另一个实施方案中，本发明提供了所述基因作为筛选标记在南抗杨遗传转化中 的应用。
[0009] 在其他实施方案中，本发明提供了包含所述玉米丝氨酸消旋酶基因的植物表达载 体。在一个实施方案中，所述载体是用所述玉米丝氨酸消旋酶基因取代植物双元表达载体 PCAMBIA1301上的⑶S基因，从而构建得到的植物表达载体。在另一实施方案中，所述植物 表达载体能作为一种筛选标记基因在南抗杨遗传转化应用。
[0010] 有益效果：本发明提供了一个玉米丝氨酸消旋酶能作为一种筛选标记基因在南抗 杨遗传转化应用。该基因第一次作为筛选标记应用于南抗杨的遗传转化体系中，是一种无 抗性选择标记基因，较抗生素作为筛选标记不仅可以筛选出阳性抗性植株，而且可以对植 株体内的D-丝氨酸具有解毒功能，具有低污染率，对植株生长发育以及对环境安全、无危 害。因此，研宄该标记基因对植物转基因，尤其是在对大规模转基因南抗杨苗的筛选具有重 要的科学意义和应用前景。
【附图说明】
[0011] 图lpBI1301-ZmSR载体双酶切结果
[0012] M，DL-2000Marker1，NcoI和BstpI双酶切条
[0013] 图2D-丝氨酸临界浓度筛选试验
[0014] A，叶片分化抗性筛选结果；B，生根抗性筛选结果。
[0015] 图3转基因株检测图
[0016]M，DL2000 ; 1，ddH20 ; 2,为未转化植株叶片基因组（阴性对照）；3,重组质粒 (阳性对照）；4-6,D-丝氨酸抗性植株叶片基因组；
[0017] 图4转基因植株的对比结果图
[0018]CK，未转化植株；⑶S，转含⑶S基因pBI121载体载体植株；SR，转pBI1301-ZmSR载 体植株
[0019] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
【具体实施方式】
[0020] 所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上海生工公司测序；Taq酶、 Trans5a感受态及相关的试剂盒购置北京全式金公司；限制性内切酶NcoI和BstpI，T4 连接酶购自TaKaRa公司；相应的抗生素来自上海生工和SIGMA公司；其余试剂均为国产分 析纯。本研宄所用的表达载体PBI121以及根癌农杆菌LBA4404由本实验室保存，双元表达 载体PCAMBIA1301由生命科学学院作物生物重点实验室惠赠。下述实施例中所用方法如无 特别说明均为常规方法。
[0021] 实施例1.载体构建与转化
[0022] 以玉米B73自交系三叶期cDNA为模板克隆获得，根据NCBI网站公布序列 (NM_001143028. 1)设计引物，上游加NcoI(CCATGG)酶切位点，下游加BstpI(GGTAACC)酶 切位点，引物如下：
[0023]引物 1 (上游引物）：5 ' -CATGCCATGGATGGGAAGTAAAGACGGCACCGG-3 '
[0024]引物 2(下游引物）：5' -GGGTAACCTCAGTGTTTGTACATAGACTG-3'
[0025] PCR得到约lOOObp条带，回收后，将回收产物用NcoI和Bs