tPI双酶切获得酶切之 后的序列A。将pCAMBIA1301载体用NcoI和BstPI双酶切，回收线性化的质粒。用T4连接酶 连接得酶切之后的序列A和线性化的质粒获得重组载体，重组载体命名为pBI1301-ZmSR， 重组载体转入Trans5a感受态中获得转化菌株，将菌液送生工测序，得到结果与报道的序 列一致，转入的基因为玉米丝氨酸消旋酶基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:1所 示。酶切体系如下：
【主权项】
1. 一种用于南抗杨遗传转化筛选标记的基因，其特征为所述基因为玉米丝氨酸消旋酶 基因ZmSR。
2. -种获得如权利要求1所述玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的方法，其特征为步骤如 下： 以玉米B73自交系三叶期cDNA为模板克隆获得，根据NCBI网站公布序列 (NM_001143028. 1)设计引物，上游加NcoI(CCATGG)酶切位点，下游加BstpI(GGTAACC)酶 切位点，引物如下： 引物 1(上游引物）：5' -CATGCCATGGATGGGAAGTAAAGACGGCACCGG-3' 引物 2(下游引物）：5' -GGGTAACCTCAGTGTTTGTACATAGACTG-3' PCR得到约1000 bp条带，回收后，将回收产物用NcoI和BstPI双酶切获得酶切之后 的序列。
3. 权利要求1所述的玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR作为南抗杨遗传转化的筛选标记基 因的应用。
4. 一种制备含玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的植物表达载体的方法，其特征为步骤如 下： (1) 以玉米B73自交系三叶期cDNA为模板克隆获得，根据NCBI网站公布序列 (NM_001143028. 1)设计引物，上游加NcoI(CCATGG)酶切位点，下游加BstpI(GGTAACC)酶 切位点，引物如下： 引物 1(上游引物）：5' -CATGCCATGGATGGGAAGTAAAGACGGCACCGG-3' 引物 2(下游引物）：5' -GGGTAACCTCAGTGTTTGTACATAGACTG-3' (2) PCR得到约1000 bp条带，回收后得回收产物A，将回收产物用NcoI和BstPI双酶 切获得酶切之后的序列A;将pCAMBIA1301载体用NcoI和BstPI双酶切，回收线性化的 PCAMBIA1301载体；用1\连接酶连接得酶切之后的序列A和线性化的pCAMBIA1301载体获 得重组载体，重组载体命名为pBI1301-ZmSR，即包含如权利要求1所述的玉米丝氨酸消旋 酶基因ZmSR的植物表达载体pBI1301-ZmSR，pBI1301-ZmSR载体转入Trans5a感受态中获 得转化菌株，将菌液送生工测序，得到结果与报道的序列一致，转入的基因为玉米丝氨酸消 旋酶基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 1所示。 酶切体系如下：
5. -种含植物表达载体pBI1301-ZmSR的农杆菌的制备方法，其特征为步骤如下：将验 证正确的pBI1301-ZmSR载体通过液氮冻融法转化到农杆菌LBA4404中，用无菌牙签挑取 ￥￡卩平板上的单菌落，接种于适量的含1^11(100 1^/1^)、把€(100 1^/1^)的液体￥￡?培养基 中，振荡培养过夜培养；对农杆菌LBA4404的质粒进行酶切鉴定确认，获得含pBI1301-ZmSR 载体的农杆菌LBA4404。
6. 权利要求4所述的植物表达载体pBI1301-ZmSR作为表达南抗杨遗传转化的筛选标 记基因的应用。
7. 根据权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于能以根癌农杆菌LBA4404作为宿 主，导入到南抗杨叶片和愈伤组织中。
8. -种向南抗杨组织转入如权利要求1所述玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的方法，其特 征为步骤如下： (1) 以玉米自交系B73三叶期的cDNA为模板克隆得到的基因序列，引入NcoI和 BstpI为上下游酶切位点，替换双元表达载体pCAMBIA1301上的⑶S标记基因获得载体 pBI1301-ZmSR，将载体pBI1301-ZmSR导入到根癌农杆菌LBA4404中； (2) 分别对南抗杨叶片分化和不定芽生根进行D-丝氨酸的敏感性试验，确定叶片分化 和生根时的临界浓度； (3) 以南抗杨组培苗的叶片为材料，通过农杆菌介导法将载体pBI1301-ZmSR导入到叶 片以及愈伤组织进行遗传转化，并以含有GUS基因的pBI121转化南抗杨的叶片以及愈伤组 织作为对照； (4) 通过PCR分子检测转化株的阳性率。
9. 一种向南抗杨组织转入如权利要求1所述玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的方法，其特 征为步骤如下： (1) 受体材料的预培养 将待培养的南抗杨叶片剪成〇. 5cmX0. 5cm的块状，接种在叶片不定芽诱导培养基上 进行预培养7d，待叶片切口处刚刚开始膨大时即可进行培养； (2) 工程菌制备 从-70°C冰箱取出含pBI1301-ZmSR载体的农杆菌LBA4404,蘸取少量菌体，接种于含Kan50mg/L，Rif50mg/L的YEP平板上，于28°C遮光培养24h后，从活化平板上挑取单菌落 接种于有抗生素的YEP液体培养基中，28°C，220rpm培养约24h，视菌液浓度用不含抗生素 的YEP液体培养基按1:50或1:100的比例进行稀释，28°C220rpm振荡培养4h，至相应OD6tltl 值时，4°C，5000rpm离心5min收集菌体，用相同体积的含200ymol/LAS的MS液体培养基 悬浮备用； (3) 侵染与共培养 将菌液倒入三角瓶中，将经过7d预培养的叶片浸入菌液中，180rpm，侵染20min以后， 再把叶片接种到含AS的共培养培养基上，22°C左右遮光进行共培养3d; (4) 菌的清洗 待培养基中出现可见菌落就可以进行清洗农杆菌，先用无菌水洗叶片6次；再用400mg/L头孢霉素浸泡叶片，放入恒温摇床中振荡半个小时，用装有滤纸的培养皿吸干，最 后接种到含D-丝氨酸和Cef、Kan400mg/L的恢复培养基，25°C左右遮光进行恢复培养7d (5) 抗性愈伤组织的筛选与分化 将恢复培养7d后的材料用含15mMD-丝氨酸、400mg/LCef和50mg/LKan分化培养基 上，25°C左右光照条件下培养，每20d转入新配制的分化培养基；分别进行3次筛选培养，最 终获得抗性苗； (6) 生根选择培养 待不定芽苗长到Icm以上，转入含有插入生根培养基1/2MS+IBA2mg/L+Kan50mg/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L和 1/2MS+IBA2mg/L+D-丝氨酸 12. 5mM+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L上 进行筛选培养上进行生根培养； (7) 炼苗和移栽 在室内炼苗7d后，取出苗；洗净根部后栽入营养钵中，浇蒸馏水浸湿，然后转移至光照 培养箱中，炼苗2周左右，待新的根系形成，浇一次复合肥水，5d后将成活的幼苗移入大棚 (冬季），获得转基因杨树；如夏季炼苗，成活后可直接栽入大田，获得转基因杨树。
【专利摘要】本发明涉及一种利用玉米丝氨酸消旋酶基因作为筛选标记在南抗杨转化体系中的应用。本发明以玉米自交系B73三叶期的cDNA为模板克隆得到的一段基因序列(ZmSR)，将该基因替换双元表达载体pCAMBIA1301上的GUS标记基因，将该载体命名为pBI1301-ZmSR。以南抗杨组培苗的叶片为对象，通过农杆菌介导的遗传转化，将pBI1301-ZmSR载体导入到南抗杨中，并以南抗杨的叶片和不定芽分别进行D-丝氨酸的抗性筛选，从而获得转基因南抗杨植株。与传统筛选标记相比，丝氨酸消旋酶为一种无抗性选择标记基因，对转化植物中的D-丝氨酸具有解毒作用，对生态环境不会造成污染，是一种安全的筛选标记基因。
【IPC分类】C12N15-84, C12N15-55, A01H5-00, C12N15-66, C12N15-10
【公开号】CN104711277
【申请号】CN201510121979
【发明人】项艳, 范军, 王婕, 赵康, 董庆, 陈竹
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月19日