一种稻瘟病抗性基因Pi1功能特异性分子标记及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种稻瘟病抗性基因Pi1功能特异性分子标记及其应用，是通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出与稻瘟病抗性基因Pi1呈特异性带型的分子标记。本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pi1基因特异性分子标记具有重要的应用价值，利用此标记可以提高该基因在种质资源筛选、分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。
【专利说明】
一种稻瘟病抗性基因 P i 1功能特异性分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因朽2功能性分子标记 Pil-InDel及其方法与应用。
【背景技术】
[0002] 由稻痕病菌(AfegTjajOoiAe orjzae)引起的稻痕病害是对水稻稳产危害最重要的病害， 几乎给世界水稻的主产区都会造成严重的粮食损失(Qu 1985，Ma et al. 2015)。长期的生 产实践表明，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病最为安全有效的方法。况且由于稻瘟病生 理小种致病性变异频繁，导致单一抗性品种的抗性会在种植后的3~5年时间里逐渐丧失 (殷得所等，2011);因此，挖掘和合理利用广谱抗性基因是获得持久、广谱抗病品种的重要 途径。常规抗性基因鉴定方法有接种鉴定，但由于不同抗性基因在抗谱上有一定的交叉性， 因此常规接种鉴定方法不足以准确、真正地反映出基因型。近几十年来，随着水稻抗病分子 遗传学的发展，很多抗性基因得以被精细定位或克隆（Su et al. 2015)，并且分子标记的 发展及应用大大促进了抗性基因遗传背景的鉴定以及多抗病基因聚合育种的发展 (Hittalmani et al · 2000; Jena and Mackill，2008)。在已克隆的抗性基因中，一些抗病 基因位于同一位点，这些复等位基因之间、功能型序列与非功能型之间序列高度同源，一 般的连锁标记仍然难以准确酿别各种材料的功能抗病基因 （Qu et al. 2006; Zhou et al. 2006; Ashikawa et al. 2008; Takahashi et al. 2010; Yuan et al. 2011; Zhai et al. 2011; Yuan et al. 2011; Hua et al. 2012;Ma et al.2015; Tian et al. 2016)。因此，直接分析功能等位基因本身的序列并开发其功能特异性的分子标记来对目标 基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快了育种步伐。
[0003]近年来，有关于等位位点的抗性基因的研究有了很大进展，目前该抗性位点上 至今已至少发现有5个不同抗谱的抗性基因 （Ashikawa et al. 2008; Yuan et al. 2011; Zhai et al· 2011; Hua et al· 2012);其中，源于非洲栽培稻LAC23的Λ7表现出广谱高 抗的特性(Mackill and Bonman 1992; Inukai et al· 1994)，对我国多个水稻主产区的 稻痕病小种都具有很高的抗性(Hittalmani et al· 2000; Fuentes et al· 2008; Yang et al.2008; Tacconi et al. 2010;Hua et al. 2012)。研究者已利用开发出一些与 连锁的基于PCR技术的分子标记进行分子标记辅助选择(MAS)育种工作(刘士平等，2003; 陈志伟等，2005;金素娟等，2007;Jiang et al. 2012)。然而，所用的这些标记都是位于抗 性基因的侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离，它们只能用于特定亲本间的多态性 分析，不适应于种质资源鉴定或抗性资源筛选。潘庆华等(2012)虽然开发了 功能特异性 分子标记，但由于该SNP标记使用前需要鉴定K/N型基因型，事实上该基因型存在一定的不 对应性，而且鉴定过程需要酶切鉴定等繁琐的工作(Zhai et al. 2010)，不适合大规模抗 性鉴定及MAS工作。因此，为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因 Λ7应用到水稻抗性 育种工作中，有必要开发真实反映目标基因、方便易用的寺异的分子标记。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种稻瘟病抗性基因 基因功能特异性分子标记Pil-InDel。
[0005] 本发明的另一发明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因基因特异性分子标记 Pil-InDel的检测方法。
[0006] 本发明的再一发明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因基因功能特异性分子 标记Pil-InDel的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种稻瘟病抗性基因基因功能特异性 分子标记Pil-InDel，是通过引物对SEQ ID N0.1和SEQ ID勵.2从水稻基因组0嫩中扩增出 与稻瘟病抗性基因呈特异性带型的分子标记； SEQ ID N0.U5' -3'）： GGTTGGTCGAAACCAGAAAA ; SEQ ID Ν0·2(5' _3'）：GCTGAGGTAGAAGCGGGAGC ; 所述的水稻品种为IRBL1 -CL(共体亲本）； 所述的稻瘟病抗性基因包括编码NBS-LRR类蛋白的基因片段I
[0008] 所述的稻瘟病抗性基因的功能特异性分子标记Pil-InDel的检测方法，通过比 对多个水稻稻瘟病抗性基因的等位基因序列，包含以下步骤： (1)从公共数据库中下载得到的PilS其同源的基因组序列以及测序品种日本晴 (Nipponbare)相对应区域的基因组序列，针对位点进行序列比对，筛查寺异的、能区 别于该位点其他稻痕病等位抗性基因的插入/缺失（insertion-deletion，InDel)位点； ⑵利用步骤⑴获得的InDel信息，根据InDel标记的设计原理，在所述InDel位点处 上下游100-200 bp处设计基因特异性引物，引物对碱基序列如下： Fl:5- GGTTGGTCGAAACCAGAAAA -3； Rl:5- GCTGAGGTAGAAGCGGGAGC -3; (3)以携带有稻瘟病抗性基因 Pi.稻瘟病抗性品种IRBL1 -CL的总DNA为模板，进行PCR 扩增，所获得的PCR产物即为稻瘟病抗性基因基因特异性分子标记Pil-InDel ; 所述的稻瘟病抗性基因基因特异性分子标记Pil-InDel在鉴别水稻品种稻瘟病抗 性基因的应用，特别适合于在鉴别PiA基因簇区域不同的稻瘟病抗性基因的应用;优选包含 如下步骤： (1) 扩增：利用引物F1和R1对待检测的水稻品种的基因组进行PCR; (2) 检测：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若检测到分子量大小为220 bp的核苷酸片 段，则携带有稻瘟病抗性基因;若检测到分子量大小为209 bp的核苷酸片段，则待检测 的水稻品种携带有该位点非稻瘟病抗性基因的其它功能基因；若检测到分子量大小为 265 bp或没有检测到的核苷酸片段，则待检测的水稻品种不携带PiM立点的功能基因。
[0009] 本发明的原理：InDel是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的 序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一个序列上某一位点相比同源的另一个 序列插入或缺失了一个或多个碱基(Weber et al, 2002)。111〇61标记基于?0財广增技术，本 质上属于长度多态性标记(Hyten et al, SOlOhlnDel标记稳定性好、多态性高、分型系统 简单(Jander et al, 2002);与分型系统复杂的SNP标记相比，InDel检测更加简单便捷，对 仪器设备和技术要求较低，在电泳技术平台上即可进行。目前已开始应用于动植物群体遗 传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。本发明通过多序列比对的方 法寻找基因序列上出现的InDe 1，由于这个InDe 1在与Pi女的其它功能基因有11 bp的 差异，在日本晴中不含有该位点，因此很容易将从中区分出来。本发明据此设计引物对 F1/R1，通过常规PCR扩增，在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，以不同大小的片断得以呈现。
[0010] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： (1)本发明提供的分子标记特异性高：所在的基因组区域存在着包括乃7在内的5 个具有抗性基因特征的候选基因，这些候选基因在序列上高度同源(Zhai et al. 2010); 此外，Pi』-5C与该位点上已经克隆的稻瘟病抗性基因 Λ? PiU和PiAp-J在氨基酸水平 上的序列一致性分别为99%、99%和95%，Pi^C与和在氨基酸水平上 的序列一致性都为99% (Him et al. 2012)。本发明提供的分子标记是本发明发明人经过 不断的进行序列多态性搜查并通过实验验证得到的，能明显地将Λ7与存在于该基因组区 域内与Pi^高度同源的旁系同源基因进行区分；也能成功区分Pil-s、 Pi符ΡΛ?与其它非功能同源基因。
[0011] (2)本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量：目前大多是利用电泳 平台进行分型，该分型平台快捷经济，不需要复杂的实验设备，可操作性强。电泳分型平台 有琼脂糖凝胶电泳、变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳。本发明提供的分 子标记只需PCR结合琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，成本低、通量高、加上 特异性高（即准确度高），特别适用于生产实践中。
[0012] ⑶本发明是第一个针对Λ7基因内部序列所开发的Λ7基因特异性InDel标记。本 发明能通过电泳检测的方法成功地将与定位在该位点上的其它稻瘟病抗性基因(PiA?， Pi知，Pil-s，Pi 姑）区分开，到目前为止，还没有有关这类标记的报道。本发明所 提供的寺异性分子标记Pil-InDel是一个共显性标记，在实际应用过程中其可靠性及准 确性优于显性标记。本发明可应用于的种质资源筛选、转基因鉴定和基因聚合以及基于 MAS技术的水稻抗性育种工作中。该标记存在于基因内部，因此对Pi.筛选能力理论值 可达100%，其综合性能优于已报道的与连锁的分子标记和功能标记。
[0013] (4)本发明提供的分子标记能简便地应用于遗传背景不同的群体中。现有的与 连锁的分子标记大部分都是针对同一个群体2个不同亲本的序列多态性所开发的，这些标 记在其它群体中的适用性有限。Pan et al (2012)等开发的功能标记，由于鉴定过程比较 繁琐，不适应于大规模的种质资源鉴定及MAS育种中。本发明适用于任何遗传背景下的转基 因育种，基因聚合以及基于MAS技术的抗性育种，无需重复进行亲本多态性的筛选，大大提 高了育种效率。
[0014] 因此，本发明所提供的稻瘟病抗性基因 Λ7基因特异性分子标记具有重要的应用 价值，利用此标记可以提高该基因在种质资源筛选、分子标记辅助选择育种、基因聚合育 种，以及转基因育种中利用的效率。
【附图说明】
[0015] 图1是Λ7基因特异性分子标记Pi Ι-InDel在Pi感因簇区域不同稻瘟病抗性基因 及日本晴、9311的验证结果图，其中：泳道Μ为DNA ladder，泳道1~9的DNA模板依次为抗性 品种IRBL1-CL (Pi乃、抗性品种IRBLk-Ka (Pi々)、抗性品种IRBLkp-K60 抗性品种 IRBLkm-Ts (Piii)、抗性品种IRBLkh-K3 (Λ?)、抗性品种IRBLks-S (Pil-s)、抗性品种 IRBL7-M (Pi7)、感病品种日本晴(NPB)、感病品种9311。
[0016] 图2是基因特异性分子标记Pil-InDel在其它水稻品种中的验证结果图，其中： 泳道Ml为DNA ladder，泳道1-12的DNA模板依次为抗性基因供体品种IRBL1-CL (Pi乃、珍汕 97B、Co39、辐恢838、谷丰B、金南特43B、南特号、安丰B、特青2号、包协123B、南京11号、竹珍 B、矮脚南特。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0018] 实施例1:稻瘟病抗性基因基因特异性分子标记及其引物设计与检测 (1)?11插入/缺失（111861'1：；[011-(16161：；[011，111061)位点的分析： 从公共数据库中下载得到及Pi符ΡΛ?水稻供体品种的 部分基因组序列，测序品种日本晴(Nipponbare)和9311无相对应区域的基因组序列，针对 ΡΠ 位点进行序列比对，筛查寺异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异 性插入/缺失（InDel)差异位点。具有基因特异性InDel的水稻稻瘟病抗性基因性品种 IRBL1-CL (Pi乃与抗性品种IRBLk-Ka (Pi々）、抗性品种IRBLkp-K60 (Pil-p)、抗性品种 IRBLkm-Ts (Pill)、抗性品种IRBLkh-K3 (Λ?)、抗性品种IRBLks-S 和抗性品 种IRBL7-M (Pi7)的多序列比对结果下表所示：
其中，加红加粗的核苷酸即为鉴定到的基因特异性插入序列； (2)设计引物： 根据InDel标记的设计原理，在所述InDel位点处上下游100-200 bp处设计引物，引物 对碱基序列如下所示： F1: 5,-GGTTGGTCGAAACCAGAAAA-3,； R1: 57-GCTGAGGTAGAAGCGGGAGC-37 0
[0019] (3)选择水稻代表品种:选择携带有基因以及Pi感因族等位基因的代表品种 如下： 水稻品种IRBL1-CL，为供体品种(Fukuta et al. 2004)，为阳性对照； 水稻品种IRBLk-Ka，为Pi女供体品种(Fukuta et al. 2004); 水稻品种IRBLkp_K60,为Pi女-jC供体品种（Fukuta et al. 2004); 水稻品种IRBLkm-Ts，为Piii?供体品种(Fukuta et al. 2004); 水稻品种IRBLkh_K3,为Ρ?供体品种(Fukuta et al. 2004); 水稻品种IRBLks-S，为PiA-s供体品种(Fukuta et al. 2004); 水稻品种11^1^7-]\1，为/^7供体品种(？111〇^3 6七31.2004); 感病对照品种：日本晴，日本晴是日本选育的一个品种，在国家水稻数据中心 (http: //www·ricedata· cn/variety/varis/602979 ·htm ? 602979)可以获得相关信息。
[0020] 感病对照品种：9311，选育单位：江苏里下河地区农业科学研究所（http:// www.ricedata.cn/variety/varis/600611.htm)。
[0021] (4) PCR扩增，获得含有基因特异性InDel的片段 利用上述引物对F1和R1，以上述水稻品种的总DNA为模板，进行常规PCR扩增后进行聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到的结果如图1所示。
[0022]扩增反应体系如下： 2 X Reaction Mix: 12.5 yL 引物 FI (10 μΜ): 1 yL 引物 R1 (ΙΟμΜ): 1 yL Golden DNA Polymerase: 0.2 yL DNA 模板（20-50 ng/yL): 1 yL ddH20:补足至 25 yL。
[0023] PCR温度循环条件如下：94°C 5分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C 30秒，35个循 环;72°C 7分钟；10°C保存。
[0024] PCR反应结束后，取适量样品在8 %的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件 为90 V，1小时。
[0025]其中，图1的泳道I为供体品种水稻品种IRBL1-CL基因组为模板PCR得到的片 段，与稻瘟病抗性基因呈特异性带型，即泳道1为基因特异性分子标记Pil-InDel。 图1的结果显示，基因特异性分子标记既能区分抗感等位基因，又能区分PiM立点上所鉴 定到的其它抗性基因。也就是说，凡是携带有的水稻品种，其PCR扩增产物的电泳检测条 带以220 bp呈现，在PiM立点上所定位的其它稻瘟病抗性基因以电泳检测条带209 bp呈现， 而不含有该位点的功能基因以电泳检测条带265 bp或无带呈现。
[0026]实施例2:抗性基因 Λ7基因特异性分子标记在鉴别Pi女基因簇区域不同稻瘟病抗 性基因的应用。
[0027]根据多态性的PCR产物条带，可以把含有目标基因 Λ7与其它Pi感因簇上的抗性 基因区分开来。如图1所示，根据条带位置可以将与该位点所鉴定到的其它抗性基因区 分开来，220 bp表示含有基因，209 bp则表示含有该位点的其它抗性基因，其它带型表 示不含有该位点的功能基因。可见试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因基因特 异性分子标记可在鉴别基因与PiA基因族等位基因等方面得到应用。
[0028]实施例3:抗性基因基因特异性分子标记在其它水稻品种中的检测应用 选择12个代表性水稻品种，依次为：珍汕97B、Co39、辐恢838、谷丰B、金南特43B、南特 号、安丰B、特青2号、包协123B、南京11号、竹珍B、矮脚南特。
[0029]分别提取其基因组DNA，并以此为模板，按照实施例1的方法，进行PCR扩增、酶切及 电泳检测。根据酶切产物(条带）的大小，可以把抗性基因与其他稻瘟病抗性基因区分开 来。如图2所示，在抗谱表型为Λ7型的个体(携带有稻瘟病抗性基因的抗病品种IRBL1-CL，泳道1的样品）中能检测到Pil-InDel基因特异性分子标记的存在，而其他抗谱表型的 个体则不能检测到该分子标记。可见，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因乃7基 因特异性分子标记可在鉴别基因与其他稻瘟病抗性基因，包括PiA基因簇等位基因等方 面得到应用。
[0030]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种稻瘟病抗性基因基因功能特异性分子标记的引物对，其特征在于:所述引物 对序列为SEQ ID N0.U5' -3'）： GGTTGGTCGAAACCAGAAAA ; SEQ ID N0.2(5' -3'）：GCTGAGGTAGAAGCGGGAGC 。2. -种稻瘟病抗性基因基因功能特异性分子标记，其特征在于：是通过引物对SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2从水稻基因组DNA中扩增出与稻瘟病抗性基因呈特异性带型的 分子标记。3. 根据权利要求2所述的一种稻瘟病抗性基因 Λ7基因功能特异性分子标记，其特征在 于:所述的稻瘟病抗性基因包括编码NBS-LRR类蛋白的基因片段1，1序列如SEQ ID NO.3 所示。4. 如权利要求2所述的稻瘟病抗性基因 Λ7的功能特异性分子标记的检测方法，其特征 在于:通过比对多个水稻稻瘟病抗性基因的等位基因序列，包含以下步骤： (1) 从公共数据库中下载得到的PilS其同源的基因组序列以及测序品种日本晴相对 应区域的基因组序列，针对位点进行序列比对，筛查寺异的、能区别于该位点其他稻 痕病等位抗性基因的插入/缺失（insertion-deletion, InDel)位点； (2) 利用步骤（1)获得的InDel信息，根据InDel标记的设计原理，在所述InDel位点处 上下游100~200bp处设计基因特异性引物，引物对碱基序列如下： Fl:5_ GGTTGGTCGAAACCAGAAAA _3; Rl:5- GCTGAGGTAGAAGCGGGAGC -3； (3)以携带有稻瘟病抗性基因的稻瘟病抗性品种I RBLl -CL的总DNA为模板，进行PCR 扩增，所获得的PCR产物即为稻瘟病抗性基因基因特异性分子标记Pil-InDel。5. 如权利要求2所述的稻瘟病抗性基因 Λ7基因特异性分子标记在鉴别水稻品种稻瘟 病抗性基因的应用。6. 根据权利要求2所述的的稻瘟病抗性基因 Λ7基因特异性分子标记在鉴别PiA基因簇 区域不同的稻瘟病抗性基因的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105950747SQ201610384084
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】田大刚, 陈松彪, 胡昌泉, 陈在杰, 陈子强, 林艳, 王 锋
【申请人】福建省农业科学院生物技术研究所