稻瘟病抗性基因Pi50及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种稻瘟病抗性基因，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi50及其制备 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是最重要的粮食作物之一，全球约有一半以上的人口以稻米为主食，而稻瘟 病菌（Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病对水稻的安全生产造成严重的危害，每年都造成 严重的粮食损失。从农业可持续发展的观点来看，选育和利用抗病品种是防治稻瘟病的最 有效、最安全环保的方法，然而稻瘟病菌群体的多样性及易变性，以及人们缺乏对抗性基因 的充分了解和有效利用，导致单一抗病品种抗性的短命化（通常仅2-4年），而成为育种学 家最为棘手的问题（郑钊等2009)。因此合理挖掘、克隆和利用广谱抗病基因，是获得持久、 广谱抗病品种的重要途径，已成为农业科研中优先解决的重要问题。
[0003] 迄今，人们已经鉴定出80多个水稻稻瘟病抗性基因（Ballini et al.，2008 ;鄂 志国等2009 Jiang et al.，2012)，至少22个抗瘟基因已被克隆（Wang et al.，1999; Qu et al.，2006 ;Hayashi et al.，2010 ;Jiang et al.，2012 ;Hua et al.，2012 ;Das et al.，2012)。研宄表明，这些抗瘟基因多数是具有核苷酸结合位点-富亮氨酸重复结构 (NBS-LRR)的蛋白质，即N-端存在核苷酸结合位点（nucleotide binding site, NBS)， C_端存在富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat, LRR)。NBS结构域可能参与信号传导 (Hammond-Kosack&Jones 1997)，NBS具有结合ATP或GTP以及水解酶的活性，可以激活激酶 或G蛋白（Traut et al.，1994) ;LRR结构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质的相互作用 (Jones&Jones, 1996 ;Dangl&Jones, 2001 ;Takken&Tameling, 2009 ;Bernoux, 2011)，推测是 抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接产物相互作用的部位（Bent, 1996 ; Baker et al.，1997)。Jia et al. (2000))。通过酵母双杂交证明AVR-Pita编码的激发子 与Pita受体LRD区域的结合，能激活细胞内Pita介导的防卫反应，直接证明了 LRR结构域 可能就是病原菌识别的区域。
[0004] NBS-LRR基因有成簇排列的倾向，通常簇内基因的同源性很高，与相同抗性途径的 基因也维持着共遗传的规律（Michelmore&Meyers, 1998 ;Leister, 2004)。水稻第6染色 体长臂的Pi2/9基因簇是科学家的研宄热点，从该位点区域已报道并深入研宄的抗瘟基因 有屮12、？19、？1 8111(〇、？1-2及？12-1他们分布在2-9个他5-1^1?成员组成的基因簇内。人 们证明了 Pi2、Pi9和Pi-z中单个NBS-LRR基因具有广谱抗瘟作用（Zhou，2006, 2007 ;Dai， 2010)，其中，Pi2和Piz-t的LRR区域仅8个氨基酸残基的差异就产生了不同的产物及抗 性（Qu et al.，2006 ;Zhou et al.，2006)。而其中更多的NBS-LRR抗病基因正在被进一步 的挖掘和利用，该基因簇的应用前景可观。
[0005] 对于该区域抗病基因的克隆以及充分的认识，可以更好地控制和降低稻瘟病菌对 水稻的危害，也是了解水稻抗稻瘟病基因成簇机制的前提。同时，可能通过对基因关键位点 的修饰和改造，拓宽植物的抗谱，或者进行更精确地靶向育种。
【发明内容】
[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种稻瘟病抗性基因 Pi50〇
[0007] 本发明的另一目的在于提供所述稻瘟病抗性基因Pi50的制备方法与应用。
[0008] 本发明的再一目的在于提供所述稻瘟病抗性基因Pi50的编码蛋白。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种稻瘟病抗性基因Pi50,其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示：
[0010] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50的长度为3099个核苷酸，能编码1032个氨基酸的蛋 白质；
[0011] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50的制备方法，可通过化学合成方法得到，或是设计引 物，以EBZ基因组DNA为模板，PCR扩增得到；
[0012] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50的应用，可将其用于选育对稻瘟病具有抗病性的水 稻；具体步骤如下：将稻瘟病抗性基因Pi50转入易感病的水稻中，得到具有抗病性的水 稻；
[0013] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50编码的蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0014] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50编码的蛋白序列共计1032个氨基酸，包含2个 主要的结构域：NBS和LRR区域，其中包括含有保守的AAA kinase结构域的NBS区域 (170-462aa)，以及C-末端的富亮氨酸的LRR重复区域（578-1032aa)，其亮氨酸含量（67of 454)为 14. 8%。
[0015] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供的稻瘟病抗性基因 Pi50转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多 个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且 可以缩短育种时间。抗病基因的克隆是克服传统育种中难以在植物种间转移抗病基因的问 题的前提。本发明能够进一步提供或应用基于上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相 应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种 子。可以通过有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株中。
【附图说明】
[0016] 图1是Pi2/9等位基因对稻瘟病菌群体抗谱的比较图。
[0017] 图2是水稻稻瘟病抗性基因Pi50的克隆策略图。
[0018] 图3是通过PCR鉴定转化体的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1和12为分子量标 记lkb ladder、泳道2为pCambia-Pi50-N4质粒为模板得到的PCR产物、泳道3为转化受 体品种日本晴基因组DNA为模板得到的PCR产物、泳道4为EBZ基因组DNA为模板得到的 PCR产物、泳道5-11为不同的I；转化体基因组DNA为模板得到的PCR产物。
[0019] 图4是水稻对照品种和pCambia-Pi50阳性转化体接种稻瘟病病原菌TY19七天 后的结果图；其中，自左向右，第1条叶片是感病品种日本晴、第2条叶片是水稻抗病品种 EBZ，第3~6条叶片是pCambia-Pi50阳性转化个体，第7条叶片是抗性品种IRBLzt-T，第 8条叶片是抗性品种IRBLz5-CA。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在 本发明的实施例部分，阐述了 Pi50基因的抗性特征、分离克隆、功能特征以及分子鉴定，分 离的Pi50基因能够与适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的抗性。
[0021] 本实验室的前期工作如下（参见 Zhu, et al. The identification of Pi50 (t)，a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9multigene family. Theor Appl Genet,2012(124):1295-1304)：
[0022] (1)抗性基因Pi50的抗性特征
[0023] 为了比较和明确Pi50与Pi2/9位点4个等位基因（Pi2, Pi9, Piz，Piz-t)的抗谱， 利用从广东（85个菌株），福建（40个），湖南（41个），贵州（60个），四川（66个），辽宁 (108个），吉林（60个）和黑龙江（63个）收集的总计523个稻瘟病菌株对上述5个等位基 因的所持品种（分别是 EBZ、IRBLz5-CA、C101A51、IRBL9-W、IRBLz-Fu、IRBLz-T 和 Toride) 进行了抗谱比较分析。结果表明，Pi50对绝大多数的广东、广西、四川、福建、黑龙江、吉林稻 瘟病菌群体表现较高的抗性（抗谱达到97. 7% )，由此说明该基因可在上述地区使用（图 1)〇
[0024] (2)水稻稻瘟病抗性基因Pi50的克隆策略
[0025] 本实验室先前的定位研宄表明Pi50基因定位于与Pi2/9簇基因相同的基因组区 域；Pi50基因中NBS-LRR的成簇排列特性也与Pi2/9簇基因高度相似；进一步抗谱分析显 示Pi50基因与Pi2/9簇4个等位基因相似，对大部分测试菌株表现出相同的抗性反应（Zhu et al.，2012);综合上述三方面的结果推断，Pi50也是Pi2/9的等位基因。值得注意的是， 同样位于Pi2/9基因簇的Pi50,其对应的专化性小种却与Pi2、Pi9和Piz-t的明显不同， Pi50可以抵御Pi2/9簇其他抗病基因的致病菌的侵害，而表现更宽的抗谱（图1)。图中方 框表示，各基因型对应的菌株为其致病型菌株，数字表示感病级别，1~3为高抗，4~6为 中感，7~9为高感。因此，本发明完成了 Pi50目标区域电子物理图谱的构建。亦即，以水 稻参考品种日本晴（Nipponbare)的序列信息为基础，通过生物信息学手段，把与Pi50连锁 的、以及共分离的标记与物理位置整合，由此构建了目的基因区域的重叠群图及电子物理 整合图（图2)。
[0026] 然后，申请人通过长片段 PCR 扩增（Long Rangement PCR Amplification)、染 色体步移（Chromosome Working)以及同源基因品种参考序列监控等方法，获得了优异抗 源品种28 占（EBZ，华南稻区，已在文献"Zhu, et al.The identification of Pi50(t), a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9multigene family. Theor Appl Genet, 2012 (124) : 1295-1304"公开）包含Pi50位点区域的超过lOOkb基因组序列，通过 FGenesh预测，该区域包括了 9个以上编码NBS-LRR类蛋白的基因（申请人未发表数据）。 依据该数据，本发明进行如下工作。
[0027] 实施例1稻瘟病抗性基因Pi50的分析和确定
[0028] 一、水稻稻瘟病抗性基因Pi50候选基因的注释及序列分析
[0029] 为了确定Pi50