鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的分子标记方法
【技术领域】
[0001]本发明农业生物技术领域，具体涉及一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的分子标记方法。
【背景技术】
[0002]番前黄化曲叶病毒病为中国番前黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curlvirus，TYLCV)，属于双生病毒科。番前黄化曲叶病毒病与蔬菜上常见其它病毒病(如花叶、厥叶、条斑等病毒病)相比较而言，具有暴发突然、扩展迅速、危害性强、治疗难度大等特点，是目前番茄生产上一种毁灭性的植物病害，是一种严重威胁全世界番茄生产的病害。培育抗病品种已成为防治该病害的主要技术手段。
[0003]标记辅助选择是育种的重要组成部分，加快了培育番茄杂交种的育种进程。分子标记技术已经被广泛应用于番茄抗病基因的定位，关于番茄抗双生病毒的分子标记的开发国外取得了很大进展。Zamir等将感病系M82 -1 - 8作为母本与抗TYLCV的智利番茄LA1969杂交，分析后代RFLP标记和抗性，把耐TYLCV的不完全显性的主效基因Ty-1基因定位在6号染色体的标记TG297 (4cM)和TG97 (8.6cM)附近。Ji和Scott利用感病品种‘Horizon’和抗病材料(智利番茄)杂交后的F3分离群体进行RAH)进行分析，找到了与抗TYLCV基因紧密连锁的2个RAPD标记UBC697和UBC264，并将其转化为SCAR标记。可用于标记Ty-1基因还有CAPS标记。但以上标记存在的问题是操作流程较多，有些需要酶切等，此外与标记基因的连锁程度不高。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是，提供一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的分子标记方法。旨在解决现有技术中番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的标记操作流程较多、需要酶切、与标记基因连锁程度不高的技术问题。
[0005]本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下:
[0006]一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的分子标记方法，该方法包括如下步骤:
[0007]步骤I，提取番茄的基因组DNA ；
[0008]步骤2，用分子标记引物对前述提取的番茄基因组DNA进行PCR扩增，所述分子标记引物的正向引物序列为5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)，所述分子标记引物的反向引物序列为5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示)；
[0009]步骤3，对前述PCR扩增产物进行电泳分析，如果电泳图中产生690bp的条带，则表明植株中含有黄化曲叶病毒抗性基因Ty-Ι，为抗病植株；如果电泳图中产生409bp的条带，则表明植株为含ty-Ι基因位点的株系，为不抗病植株。
[0010]进一步地，所述步骤3中PCR扩增产物的电泳图中如果同时产生690bp和409bp的条带，表明植株为含Ty-1/ty-l位点的株系，为杂抗植株。
[0011]进一步地，所述步骤2中PCR扩增的反应条件如下:
[0012]PCR的反应体系是:10ng/uL的模板DNA 3 μ L，10umol/L的正向引物2.5 μ L，10umol/L 的反向引物 2.5 yL，10mmol/L 的 dNTP 0.625 μ L，10XPCR buffer 2.5 μ L，1mmoI/L 的 Mg2+2.5ul，Taq 酶 1U，补充 ddH20 至 25 μ L ;
[0013]PCR程序分别为:94 °C预变性3min，然后94°C变性30s，退火温度57 °C 60s，72°C 60s，进行35个循环，最后72°C延伸1min。
[0014]本发明还提供了一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1的分子标记引物，其特征在于:该引物的正向引物序列为5’-CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’ (其核苷酸序列如SEQID N0.1所示)，反向引物序列为5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示)ο
[0015]本发明还提供了上述的分子标记引物在番茄黄化曲叶病毒抗性基因定位、检测或标记辅助育种中的应用。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0017](I)由于番茄黄化曲叶病毒为烟粉虱传播，传统田间鉴定方法需要的且对条件要求苛刻。本发明提供的标记方法则省去了田间鉴定所需要的长周期及对条件要求的苛刻。
[0018](2)本发明标记方法中的电泳图带型简单，易于鉴别，可直接应用于标记辅助选择，节省了时间、物力、人力，且提高鉴定的准确性。将该标记应用于苗期育种选择，能够准确的筛选出具有抗病基因的个体植株，从而加速育种进程。
【附图说明】
[0019]图1为本发明中的分子标记引物对待检测番茄材料进行PCR扩增后产物的电泳图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
[0021]实施例1，分子标记引物的筛选
[0022]采用BSA法分别构建抗病基因池和感病基因池，用于分子标记引物的筛选。
[0023]Zamir等将黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1定位在6号染色体上，与该基因连锁的RAPD标记及CAPS标记均已被筛选出。本发明根据该定位结果以及番茄基因组序列和SSR遗传图谱，新设计一系列标记引物。然后针对设计的一系列标记引物对抗病材料和不抗病材料进行多态性筛选。筛选结果只有一对引物能够扩增出多态性，可作为分子标记引物。该分子标记引物在含Ty-1位点的抗病材料中能够扩增出690bp的片段；在含ty-Ι位点的不抗病材料中则扩增出409bp的片段；对于含Ty-1/ty-l位点的杂抗植株，则同时产生690bp和409bp的片段。
[0024]进一步，通过构建的抗病基因池和感病基因池对筛选的分子标记引物进行稳定性鉴定，确定该分子标记引物扩增的多态性稳定。
[0025]筛选获得的分子标记引物为:正向引物序列为5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)，反向引物序列为5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0026]实施例2，利用筛选的分子标记引物鉴定黄化曲叶病毒