用于鉴定11个北京地方枣品种的引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用于鉴定11个北京地方枣品种的引物及其 应用。
【背景技术】
[0002] 赛（Ziziphus jujuba Mill.)，鼠李科（Rhamnaceae)，赛属（Ziziphus Mill.) 〇 枣树原产我国，是果树栽培历史最久的果树之一，为古代五果之一，也是我国当今第一大干 果。枣果实不仅营养丰富、味道甘美，同时又为补中益气、养血安神、缓和药性的常用中药， 是集营养与医疗保健于一体的优质滋补品。
[0003] 目前发现和记载的枣品种和优良类型达800多种，北京原产及引种栽培的一些枣 品种或类型命名和种植比较混乱，所以亟需种质和品种鉴定的方法。
[0004] 随着PCR技术的日益完善，许多基于PCR的分子标记大量涌现，其中，用于种质 资源鉴定及植物育种的主要分子标记有限制性片段长度多态性（RFLP)、随机扩增多态性 DNA(RAPD)、简单重复序列DNA(SSR)、扩增片段长度多态性（AFLP)以及染色体原位杂交等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供用于鉴定11个北京地方枣品种的引物及其应用。
[0006] 本发明提供了如下1)-4)中任一所述物质在鉴定或辅助鉴定待测枣为北京地方 枣品种中的应用：
[0007] 1)引物对，所述引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的 引物2组成；
[0008] 2)成套引物，所述成套引物由所述引物对和荧光引物，所述荧光引物的核苷酸序 列为序列表中序列3 ;
[0009] 3)含有所述引物对或所述成套引物的PCR试剂；
[0010] 4)含有所述引物对或所述成套引物的试剂盒。
[0011] 上述物质在区分或辅助区分北京地方枣品种中的应用也是本发明保护的范围。
[0012] 上述应用中，所述荧光引物5'末端标记荧光基团；
[0013] 所述北京地方枣品种为11个北京地方枣，所述11个北京地方枣具体为北安河脆 枣、红螺脆枣、长辛店白枣、瓶儿枣、鸡心脆枣、缨络枣、郎家园枣、西峰山大家枣、京枣39、莲 蓬籽枣和老虎眼枣。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测枣品种的方法。
[0015] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0016] 1)用上述引物对对待测枣的基因组DNA进行PCR扩增，得到待测枣PCR扩增产物；
[0017] 2)用上述荧光引物对所述待测枣PCR扩增产物进行荧光标记扩增，得到待测枣带 荧光扩增产物；
[0018] 3)将所述待测枣带荧光扩增产物进行毛细管电泳检测，
[0019] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298. 41bp和304. 3bp，则所述待测枣为或 候选为北安河脆枣；
[0020] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为303. 28bp和307. 49bp，则所述待测枣为 或候选为红螺脆枣；
[0021] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298. 25bp和302. 14bp，则所述待测枣为 或候选为长辛店白枣；
[0022] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298. 33bp，则所述待测枣为或候选为瓶儿 枣；
[0023] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为302. 15bp和304. 31bp，则所述待测枣为 或候选为鸡心脆枣；
[0024] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为349. 34bp，则所述待测枣为或候选为缨络 枣；
[0025] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298. 32bp，则所述待测枣为或候选为郎家 园枣；
[0026] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为301. 8bp和303. 85bp，则所述待测枣为或 候选为西峰山大家枣；
[0027] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为302. 29bp和304. 36bp，则所述待测枣为 或候选为京枣39 ;
[0028] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为304. 34bp，则所述待测枣为或候选为莲蓬 籽枣；
[0029] 若所述待测赛带焚光扩增产物的大小为298. 58bp，则所述待测赛为或候选为老虎 眼枣；
[0030] 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小不满足上述任一种大小，则所述待测枣不为 或候选不为11个北京地方枣品种中任一个，所述11个北京地方枣为北安河脆枣、红螺脆 枣、长辛店白枣、瓶儿枣、鸡心脆枣、缨络枣、郎家园枣、西峰山大家枣、京枣39、莲蓬籽枣和 老虎眼枣。
[0031] 本发明的实验证明，用于鉴定11个北京地方枣品种的引物，包括由序列表中序列 1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成的引物对，用上述引物对枣进行PCR扩 增，通过PCR扩增片段的大小就可鉴别是否为下列11个北京地方枣品种：1 :北安河脆枣； 2 :红螺脆枣；3 :长辛店白枣；4 :瓶儿枣；5 :鸡心脆枣；6 :缨络枣；7 :郎家园枣；8 :西峰山大 家枣；9 :京枣39 ;10 :莲蓬籽枣；11 :老虎眼赛。上述引物及方法简单，重复性好，灵敏度高， 能够准确鉴别北京11个地方品种枣。
【附图说明】
[0032] 图1为CTAB法提取的11个枣品种的DNA电泳图。
[0033] 图2为三引物扩增的11个枣品种的PCR片段。
[0034] 图3为双引物扩增的11个枣品种的PCR片段。
[0035] 图4为荧光引物扩增的11个枣品种的PCR片段。
[0036] 图5为毛细管电泳检测的枣品种1 (北安河脆枣）的SSR峰图。
[0037] 图6为毛细管电泳检测的枣品种2(红螺脆枣）的SSR峰图。
[0038] 图7为毛细管电泳检测的枣品种3 (长辛店白枣）SSR峰图。
[0039] 图8为毛细管电泳检测的枣品种4 (瓶儿枣）的SSR峰图。
[0040] 图9为毛细管电泳检测的枣品种5 (鸡心脆枣）的SSR峰图。
[0041] 图10为毛细管电泳检测的枣品种6 (缨络枣）的SSR峰图。
[0042] 图11为毛细管电泳检测的枣品种7 (郎家园枣）的SSR峰图。
[0043] 图12为毛细管电泳检测的枣品种8 (西峰山大家枣）的SSR峰图。
[0044] 图13为毛细管电泳检测的枣品种9 (京枣39)的SSR峰图。
[0045] 图14为毛细管电泳检测的枣品种10 (莲蓬籽枣）的SSR峰图。
[0046] 图15为毛细管电泳检测的枣品种11 (老虎眼枣）的SSR峰图。
[0047] 图 16 为 EcoR I -1 和 Mse I -1 的 ALFP 扩增结果。
[0048] 图 17 为 EcoR I -2 和 Mse I -2 的 ALFP 扩增结果。
【具体实施方式】
[0049] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0050] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0051] 实施例1、合成引物
[0052] 设计并合成如下引物：
[0053] BFU0377F :5 ' -CACGACGTTGTAAAACGACCCAGCTGGTATCCAATTGCT-3 '(序列 1);
[0054] BFU0377R :5 ' -ACGACGATGCCATGAAAGAT-3 '(序列 2);
[0055] M13-0377 通用引物：5 ' 6FAM?-CACGACGTTGTAAAACGAC-3 '(序列 3)，且其 5 ' 末端焚光标记FAM?。
[0056] 实施例2、鉴定11个北京地方枣品种
[0057] 11个北京地方枣品种名称如表1所示：
[0058] 表1枣的品种名称和扩增片段大小
[0059]
【主权项】
1. 如下1)-4)中任一所述物质在鉴定或辅助鉴定待测枣为北京地方枣品种中的应用： 1) 引物对，所述引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物 2组成； 2) 成套引物，所述成套引物由所述引物对和荧光引物，所述荧光引物的核苷酸序列为 序列表中序列3 ; 3) 含有所述引物对或所述成套引物的PCR试剂； 4) 含有所述引物对或所述成套引物的试剂盒。
2. 权利要求1中的所述物质在区分或辅助区分北京地方枣品种中的应用。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述荧光引物5'末端标记荧光基团。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于： 所述北京地方枣品种为11个北京地方枣，所述11个北京地方枣具体为北安河脆枣、红 螺脆枣、长辛店白枣、瓶儿枣、鸡心脆枣、缨络枣、郎家园枣、西峰山大家枣、京枣39、莲蓬籽 枣和老虎眼枣。
5. -种鉴定或辅助鉴定待测枣品种的方法，包括如下步骤： 1) 用权利要求1中所述引物对对待测枣的基因组DNA进行PCR扩增，得到待测枣PCR 扩增产物； 2) 用权利要求1中所述荧光引物对所述待测枣PCR扩增产物进行荧光标记扩增，得到 待测枣带荧光扩增产物； 3) 将所述待测枣带荧光扩增产物进行毛细管电泳检测， 若所述待测赛带焚光扩增产物的大小为298. 41bp和304. 3bp，则所述待测赛为或候选 为北安河脆枣； 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为303. 28bp和307. 49bp，则所述待测枣为或候 选为红螺脆枣； 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298. 25bp和302. 14bp，则所述待测枣为或候 选为长辛店白枣； 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298. 33bp，则所述待测枣为或候选为瓶儿枣； 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为302. 15bp和304. 31bp，则所述待测枣为或候 选为鸡心脆枣； 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为349. 34bp，则所述待测枣为或候选为缨络枣； 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298. 32bp，则所述待测枣为或候选为郎家园 枣； 若所述待测赛带焚光扩增产物的大小为301. 8bp和303. 85bp，则所述待测赛为或候选 为西峰山大家枣； 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为302. 29bp和304. 36bp，则所述待测枣为或候 选为京枣39 ; 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为304. 34bp，则所述待测枣为或候选为莲蓬籽 枣； 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298. 58bp，则所述待测枣为或候选为老虎眼 枣； 若所述待测枣带荧光扩增产物的大小不满足上述任一种大小，则所述待测枣不为或候 选不为11个北京地方枣品种中任一个，所述11个北京地方枣为北安河脆枣、红螺脆枣、长 辛店白枣、瓶儿枣、鸡心脆枣、缨络枣、郎家园枣、西峰山大家枣、京枣39、莲蓬籽枣和老虎眼 枣。
【专利摘要】本发明公开了用于鉴定11个北京地方枣品种的引物及其应用。本发明提供了如下1)-4)中任一所述物质在鉴定或辅助鉴定待测枣为北京地方枣品种中的应用，1)引物对，所述引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；2)成套引物，所述成套引物由所述引物对和荧光引物，所述荧光引物的核苷酸序列为序列表中序列3；3)含有所述引物对或所述成套引物的PCR试剂；4)含有所述引物对或所述成套引物的试剂盒。本发明的实验证明，上述引物及方法简单，重复性好，灵敏度高，能够准确鉴别北京11个地方品种枣。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104726598
【申请号】CN201510140984
【发明人】张铁强, 胡灿丽, 李子龙, 雷慧, 王志忠, 马萱
【申请人】北京农学院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月27日