用于检测人类cyp2e1基因分型的引物组及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于检测人类CYP2E1基因分型的试剂 盒（PCR-SSP 法)。
【背景技术】
[0002] 人的CYP2E1的相对分子质量为56900,主要分布在成人肝脏，并且富集于肝小叶 中心区域。CYP2E1基因位于第10号染色体上，其大小为11. 4 kb，有9个外显子和一个典型 的TATA盒子。CYP2E1的基因多态性导致了药物代谢的个体差异，CYP2E1的活性在人群中 呈正态分布，而不像CYP2D6和CYP2C19那样呈多态性分布。中国人中主要有两种突变体， CYP2E1*2和CYP2E1*3。CYP2E1*2是由于外显子2上第1168位的G - A突变引起氨基酸第 76位由Arg(R)变为His (H)，导致酶活性的降低。而CYP2E1*3则是由于cDNA第10059位的 G - A突变引起氨基酸第389位Val (V)变成lie (I)，但酶活性并无明显改变。CYP2E1*1C含 有6个重复序列，罕见的CYP2E1*1D具有8个重复序列，西方人群中仅为1%，而中国人中则 为23%。研宄发现在酒精和尼古丁依赖者中，CYP2E1*1D的突变频率要更高。CYP2E1是一类 具有较高个体差异、毒理学上非常重要的酶，它不仅参与了药物的代谢，还能催化许多前致 癌物和前毒物的活化过程。CYP2E1的底物多达75种，主要有氯唑沙宗、乙醇、醋氨酚、茶碱、 氨苯砜、吸入性的含氟麻醉药（氟烷、甲氧氟烷、异氟烷等），还有各种工业和家庭常用的化 学溶剂与环境污染物。CYP2E1的探针底物有3种：对位硝基酚（para-nitrophenol，P-NP)、 N-亚硝基双甲胺（N-nitrosodimethylamine，ND-MA)和氯挫沙宗。它们都可以用于体外试 验，其中前两者对人体有害只用于体外研宄。氯唑沙宗为中枢性肌松药，低剂量对人体无 毒。它主要在肝脏经6-羟化代谢生成6-羟氯唑沙宗，该代谢途径主要由CYP2E1催化，所 以可以作为CYP2E1的探针药物并反映其活性，是目前唯一对人体无损害的CYP2E1体内探 药。影响CYP2E1活性的因素很多，已经明确可以诱导CYP2E1的物质有：乙醇、丙酮、吡啶、 咪唑和异烟肼等，主要通过减少CYP2E1的降解和代谢，延长其作用而起诱导作用。能抑制 CYP2E1的物质有：氢辣椒素、异硫氢酸苯乙酯、二乙基二硫代氨基甲酸盐、戒酒硫、氯甲噻 唑等。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是：克服血清学检测试剂的价格昂贵，试剂不好购买等不足，提供一 种用于检测CYP2E1基因分型的引物组。
[0004] 本发明的第二个目的是提供一种具有灵敏、特异、经济、简便、快速的用于检测 CYP2E1基因分型的试剂盒。
[0005] -种用于检测人类CYP2E1基因的引物组，其特征是包括CYP2E1*1引物对， CYP2E1*5引物对及内参引物对。
[0006] 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA参考序列的NG_008383. 1 : 6149-6169和NG_008383. I :6414-66434位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0007] 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA参考序列的NG_008383. 1 : 6149-6169和NG_008383. I :6414-66434位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0008] -种用于检测人类CYP2E1基因的试剂盒，其特征是包括包被有CYP2E1*1引物对， CYP2E1*5引物对，及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。
[0009] 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA参考序列的NG_008383. 1 : 6149-6169和NG_008383. I :6414-66434位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0010] 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA参考序列的NG_008383. 1 : 6149-6169和NG_008383. I :6414-66434位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
【附图说明】
[0011] 图1为人类CYP2E1基因特异引物孔位图。
[0012] 图2为实验结果阴阳性判读图。
[0013] 图3人类CYP2E1基因测定结果分型读板纸。
[0014] 图4人类CYP2E1基因测定试剂盒电泳结果胶图。 具体实施方案
[0015] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0016] 实施例1。
[0017] 依据美国国立生物技术信息中心基因库（NCBI Gene Bank)公开的CYP2E1等位 基因序列，设计出用于检测人类CYP2E1基因的引物组，该引物组包括CYP2E1*1引物对， CYP2E1*5引物对及内参引物对。
[0018] 实施例2。
[0019] 一种用于检测人类CYP2E1基因的试剂盒，包括包被有CYP2E1 * 1引物对，CYP2E1 *5 引物对，及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buf f er。
[0020] 用于检测人类CYP2E1基因的试剂盒的制备方法是。
[0021] 1.据人类CYP2E1基因特异引物孔位图（见图1)，分别将CYP2E1*1引物对， CYP2E1 *5引物对及内参引物对包被至引物板的相应位置上，干燥处理。
[0022] 2.依据配220mM dNTP、3. 5mM Mg2+、500mM KCUlOOmM Tris-HCL、1% TritonX-IOO 制备出 440 μ I 浓缩 dNTP-Buffer。
[0023] 3.包被有引物对的引物板每人份检测包括2孔特异性引物孔，浓缩dNTP-Buffer 组成一种用于检测人类CYP2E1基因的试剂盒。
[0024] 实施例3。
[0025] 使用操作流程。
[0026] -、2. 5%琼脂糖凝胶的准备。
[0027] L将加入2. 5g琼脂糖加入100ml IXTBE溶液（Tris-硼酸盐-EDTA溶液)，加热 直到形成均匀的凝胶溶液。再加入适量电泳染色剂，混合均匀。
[0028] 2.将凝胶槽置于水平位置，向凝胶槽中加入适量凝胶溶液，插入电泳梳。前后水平 移动凝胶槽，确保凝胶溶液覆盖均匀。
[0029] 3.待凝胶完全凝固后，竖直拔出电泳梳。
[0030] 二、PCR循环参数见表1。
[0031] 表1扩增参数特征表。
【主权项】
1. 一种用于检测人类CYP2E1基因分型的引物组，其特征是包括CYP2E1*1引物对， CYP2E1*5引物对及内参引物对； 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA参考序列的NG_008383.I:6149-6169 和NG_008383.I:6414-66434位置，上、下游引物分别是序列表中SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列； 所述CYP2E1*5的上、下游引物位于CYP2E1的DNA参考序列的NG_008383.I:6149-6169 和NG_008383. 1:6414-66434位置，上、下游引物分别是序列表中SEQIDN0.3、SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列。
2. -种用于检测人类CYP2E1基因分型的的试剂盒，其特征是包括包被有CYP2E1*1引 物对，CYP2E1*5引物对，及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer; 所述CYP2E1*1的上、下游引物位于CYP2E1的DNA参考序列的NG_008383.I:6149-6169 和NG_008383.I:6414-66434位置，上、下游引物分别是序列表中SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列； 所述CYP2E1*5的上、下游引物位于CYP2E1的DNA参考序列的NG_008383.I:6149-6169 和NG_008383. 1:6414-66434位置，上、下游引物分别是序列表中SEQIDN0.3、SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测CYP2E1基因分型的引物组及试剂盒。用于检测CYP2E1基因分型的引物组包括CYP2E1*1引物对，CYP2E1*5引物对及内参引物对。本发明的试剂盒的应用实现了对CYP2E1基因的良好分型，具有广泛的应用前景和临床参考价值。在临床应用中，对实现个体化使用特定药物和安全使用特定药物具有很好的指导作用。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104726588
【申请号】CN201510127339
【发明人】赵卫军
【申请人】天津市秀鹏生物技术开发有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月24日