Aldh2基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种ALDH2基因的检测引物组、其构成 的反应体系及应用。
【背景技术】
[0002] 乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase gene, ALDH)是一类催化人体内乙醛和其 他脂肪族醛氧化反应的重要酶类。ALDH家族共有19种同工酶，其中ALDH1-ALDH4为主要常 见的4种，其中ALDHl和ALDH2主要在人体肝脏内发挥功能，并且只有ALDH2分布在线粒体 中，且编码基因具有遗传多态性。
[0003] 研究表明，ALDH2具有乙醛脱氢酶和酯酶活性，是人体代谢所摄入乙醇的主要功能 酶，同时也是临床药物硝酸甘油的主要代谢酶类。因此，ALDH2编码基因的遗传多态性对 于乙醇和硝酸甘油的代谢具有十分重要的影响。ALDH2基因位于人类第12号染色体上，在 该基因片段上发现的单核苷酸酸多态性位点（SNP)已有上百个，其中ALDH2*2(Glu504Lys， rs671)可导致ALDH2基因功能缺失并失去酶活性。在人体乙醇代谢过程中，突变型基因 ALDH2*2的存在可引起ALDH酶活性的大幅降低，严重阻碍乙醇在体内的代谢进程，导致大 量乙醛在人体内蓄积，从而导致肝损伤的出现；因此，CFDA颁布的《药物代谢酶和药物作用 靶点基因检测技术指南（试行）》指出"携带ALDH2*2等位基因的心绞痛患者尽可能改用其 他急救药物，避免硝酸甘油舌下含服无效。"
[0004] 另外有研究结果显示，与欧美及其它国家地区人群相比，亚洲人群携带ALDH突变 型基因的频率相对较高，约为35% -40%。因此，在亚洲国家和地区开展ALDH基因多态性 检测，对于预防乙醇代谢障碍造成的肝损伤以及硝酸甘油的临床用药指导，具有很重要的 现实意义。
[0005] 目前，市场是针对ALDH突变型基因的检测技术手段主要包括基因芯片法、一代测 序法、荧光定量PCR法等。其中，基因芯片法技术步骤繁琐，样本处理时间较长，大批量处理 操作困难，单次检测成本高，还需要购置额外的检测设备；一代测序法同样存在成本高和操 作复杂、检测周期长等不利因素；而荧光定量PCR则存在临床检测假阳性率较高等缺点。CN 104894256 A公开了一种检测乙醛脱氢酶2基因 rs671多态性位点的引物、试剂盒及其PCR 方法，其中包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物 与突变型特异性上游引物共用的下游引物。然而，从目前来看，这种方法仍然需要通过变温 PCR技术，过程复杂，检测耗时长。因此，开发一种成本较低，操作简易且检测效率高，利于临 床大范围普及推广的试剂盒，对于ALDH基因多态性检测具有十分重要的意义。
[0006] 环介导的等温扩增（LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技 术，其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生IO9-IOlti数量级的产物。具 有敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。
【发明内容】
[0007] 本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种ALDH2基因的检测引物组、其构成的 反应体系及应用，所述检测引物组具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。
[0008] 为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 第一方面，本发明提供一种ALDH2基因的检测引物组，所述检测引物组如下：
[0010] 正向外侧引物 F3 :SEQ ID N0:1 :CGGGAGTTGGGCGAGTAC ;
[0011] 反向外侧引物 B3 :SEQ ID N0:2 :AGCAGGTCCTGAACTTCCA ;
[0012] 正向内侧引物 FIP :SEQ ID NO: 3 :CAAGCCCCAACAGGCCCTGGGGCTGCAGGCATACAATA ;
[0013] 反向内侧引物 BIP :SEQ ID N0:4 :TCGGAGCCTGCTGGGGGATTGCAGGTCCTGAACCTCTGG。
[0014] 优选地，所述SEQ ID NO:3所示的序列是用于检测ALDH2*2的特异性引物。
[0015] 本发明中，4条引物的外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3，内侧引 物记为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了 Flc和F2, BIP包含了 Blc 和B2。本发明在普通LAMP的基础上，针对ALDH2*2特异位点设计等位基因特异引物，特异 引物位于F2的3'端，同时为进一步加强引物的特异性，在F2的3'端倒数第三位再引进一 个突变，进一步降低非特异性扩增的可能性。
[0016] 第二方面，本发明提供一种检测ALDH2基因的反应体系，所述反应体系包括如第 一方面所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，羟基萘酚蓝，甜菜碱，Bst DNA聚合酶，待检样品 基因组DNA和去离子水。
[0017] 优选地，所述反应缓冲液包括 Tris-HCl，KC1，（NH4)2SO4, MgSOjP Tween-20。
[0018] 优选地，所述 Tris-HCl 的浓度为 10-30mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、13mM、 15mM、16mM、18mM、20mM、22mM、23mM、25mM、26mM、28mM 或 30mM，优选为 15-25mM，进一步优选 为 20mM。
[0019] 优选地，所述 KCl 的浓度为 10-60mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、15mM、18mM、 20mM、23mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM 或 60mM，优选 为50-55mM，进一步优选为50mM。
[0020] 优选地，所述（順4)#04的浓度为5-13mM，例如可以是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、 10禮、111111、121111或131111，优选为8-121111，进一步优选为1〇1111。
[0021] 优选地，所述MgSOj^浓度为2-8mM，例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM或 8mM，优选为3_6mM，进一步优选为4mM。
[0022] 优选地，所述Tween-20的体积分数为0. 1-1%，例如可以是0. 1%、0. 2%、0. 3%、 0· 4%、0· 5%、0· 6%、0· 7%、0· 8%、0· 9%或 1%，优选为 0· 1%。
[0023] 优选地，所述 dNTPs 的浓度为 l-2mM，例如可以是 lmM、l. lmM、l. 2mM、l. 3mM、l. 4mM、 I. 5mM、I. 6mM、I. 7mM、I. 8mM、I. 9mM 或 2mM，优选为 I. 2-1. 8mM，进一步优选为 I. 4mM。
[0024] 优选地，所述羟基萘酚蓝的浓度为108-130 μΜ，例如可以是108 μΜ、109μΜ、 110 μ M、111 μ Μ、112 μ Μ、115 μ Μ、116 μ Μ、118 μ Μ、120 μ Μ、122 μ Μ、125 μ Μ、126 μ Μ、128 μ M 或130 μ Μ，优选为115-123 μ Μ，进一步优选为120 μ Μ。
[0025] 优选地，所述甜菜碱的浓度为0. 3-1. 2Μ，例如可以是0. 3Μ、0. 4Μ、0. 6Μ、0. 8Μ、1Μ或 I. 2Μ，优选为0. 5-1Μ，进一步优选为1Μ。
[0026] 优选地，所述反应体系中每25 μ L反应体系含有以下组分：
[0027] 缓冲液：
[0028] Trxs-MCI 2ΘιηΜ KCl 50 mM
[0029] (NH4)2SO4 IOmM MgSO4 4 mM Tween-20 0.1% (体积分数) dNTPs 1.4 mM 羟基萘酚蓝 LO μΜ 甜菜碱 IM F3 0.4 μ.Μ B3 0.4 uM ( FIP 1.6 μΜ BiP 1.6 μΜ Bst DNA聚合酶 8 U ?寺检测样品基因组 0.8-4 ng/pL 上离T水加至25 μ U
[0030] 第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的反应体系的使用方法，所述方法包 括如下步骤：
[0031] 将反应体系所需各组分混合完毕，放置于恒温水浴锅进行反应，反应后升温进行 灭活处理，再根据体系颜色变化判定结果。
[0032] 优选地，所述恒温水浴锅的温度为55-70 °C，例如可以是55 °C、56°C、57 °C、58 °C、 59 °C、60 °C、61°C、62 °C、63 °C、64°C、65 °C、68 °C、69 °C 或 70 °C，优选为 58-65 °C，进一步优选 为 63°C。
[0033] 优选地，所述反应时间为15_90min，例如可以是15min、20min、25min、30min、 35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min 或 90min，优 选为55_62min，进一步优选为60min。
[0034] 优选地，所述升温后的温度为78-90°C，例如可以是78°C、79°C、80°C、81 °C、82°C、 83 °C、84°C、85 °C、86 °C、87 °C、88 °C、89 °C 或 90 °C，优选为 80-85 °C，进一步优选为 80 °C。
[0035] 优选地，所述升温后的反应时间为15_30min，例如可以是15min、16min、17min、 18min、19min、20min、22min、25min、26min、28min 或 30min，优选为 18_26min，进一步优选为 20min〇
[0036] 优选地，所述根据体系颜色变化判定结果为：
[0037] 所述反应体系为天蓝色，则携带ALDH2*2基因；
[0038] 所述反应体系为紫罗兰，则未携带ALDH2*2基因。
[0039] 第四方面，本发明提供一种检测ALDH2基因的检测试剂盒，所述试剂盒包含如第 二方面所述的反应体系。
[0040] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：<