裸鼹鼠细胞因子il-6基因pcr检测引物及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体设及裸廳鼠细胞因子IL-6基因检测技术。
【背景技术】
[0002] 裸廳鼠化eterocephalusgl油er，nakedmolerat,NMR)是一种特别的晒齿类 动物，其寿命是晒齿类动物中最长的，最老的个体超过30岁，20岁左右的动物身体状态 普遍良好，超过25岁的裸廳鼠表现虚弱的迹象，大都死于老年病；裸廳鼠死于癌症的情况 从未发现，解剖结果也从未发现肿瘤，具有一定的抗癌机制。裸廳鼠抗肿瘤特性机制的探 索将给肿瘤的研究翻开新的篇章。目前，很多的基础、临床和流行病学的研究已经证实， 炎症是一个明确可W导致肿瘤的危险因素。病原学导致某种特定肿瘤发病的机制并不适 用于其他癌种，但是本质上的发病机制都是相同的，就是炎症的诱导和维持。白细胞介素 6(;[]1161'16址;[]1-6，比-6)(人比-6的66]1610:3569，小鼠比-6的66]16 10:16193)能诱导 B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应答，是炎性反应的 促发剂。因此，对裸廳鼠IL-6基因表达水平的检测有利于掲示其可能存在的抗肿瘤特性的 机制。
[0003] 目前，由于裸廳鼠性成熟晚（雌性性成熟年龄为228天，是小鼠的6. 5倍；雄性性 成熟年龄为12个月，是小鼠的8.1倍）、妊娠期长（68天，是小鼠的3.2倍），且野生裸廳鼠 生活在炎热、干燥的东非地区，终生在黑暗的地下，难W捕捉。因此，裸廳鼠的数目相对较 少，极大地制约了它的应用研究。体外培养的细胞具有分裂和增殖能力，适应性强，易培养 等特点，因此，体细胞培养技术可W解决裸廳鼠研究材料来源较少的问题。
[0004] 目前，研究中对细胞因子比-6基因表达的检测主要通过化ISA检测试剂盒进行， 该方法中需要应用特异性抗体，然而目前尚没有针对裸廳鼠的特异性抗体。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述现有技术的不足，本发明提供了裸廳鼠细胞因子IL-6基因PCR检测 的引物及检测试剂盒，利用PCR检测技术定量和定性的检测比-6基因表达，简单快捷，适合 推广使用。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种裸廳鼠细胞因子比-6基因PCR检测引物：
[0007] 正向引物：5,-ACGCTAGTCCTCCACGAT-3,（沈QIDN0:1)，
[0008] 反向引物：5'-GGTTGTTTAACATTGCCTTT-3'（沈QIDN0:2)。
[0009] 本发明的第二方面，提供一种裸廳鼠细胞因子比-6基因PCR检测试剂盒，其检测 引物为：
[0010] 正向引物：如沈QIDNO: 1所示，
[0011] 反向引物：如沈QIDN0:2所示。
[0012] 上述裸廳鼠细胞因子IL-6基因PCR检测试剂盒，还包括：
[0013] 2XSYBRPremixExTaq加1，R0XReferenceDye(50X) 0. 2ul，（1地2〇 3.6ul。
[0014] 较佳的，本发明所述的一种裸廳鼠细胞因子IL-6基因PCR检测试剂盒，包括：
[001引正向引物：如沈QIDNO: 1所示，
[0016] 反向引物：如沈Q IDN0:2所示；
[0017] 2XSYBRPremixExTaqSul；
[0018]ROXReferenceDye(50X)0.2ul；
[001引（1地20 3.6ul。
[0020]本发明的第Ξ方面，提供了 一种裸廳鼠细胞因子IL-6基因的检测方法，所述的 检测方法利用上述特异性检测引物；或利用上述检测试剂盒，所述的检测方法包括如下步 骤：
[002。 提取裸廳鼠巨隧细胞细胞的总mRNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用 Real-timePCR方法进行检测，得出IL-6的表达水平，引物序列如下：
[0022] 正向引物：如沈QIDNO: 1所示，
[0023] 反向引物：如沈Q ID NO:2所示；
[0024] 上述裸廳鼠细胞因子IL-6基因的检测方法，具体检测步骤为：
[00巧]1)提取mRNA:
[0026] 分离培养裸廳鼠巨隧细胞，提取细胞总RNA，并反转录为cDNA。
[0027] 2)制备实时巧光定量PCR反应体系lOul
[0028]取步骤 1)中cDNA模板 0. 8ul，2XSYBRPremixExTaq加 1，PCR正向引物 (1〇μΜ)〇.2ιι1，PCR反向引物（lOuM)O.化1，ROXReferenceDye(50X)0.2ul，ddH2〇 3.6ul。设置阴性对照。
[002引如进行PCR反应
[0030] 反应循环设置为：保溫阶段95°C30s循环阶段95°C5s，60°C34s，72°C30s，40个 循环；溶解曲线阶段95"€153,60"€1111；[]1，95"€153,40个循环。
[0031] 本发明的技术效果如下：
[0032] 所用的引物针对裸廳鼠IL-6的mRNA水平进行检测，提取裸廳鼠巨隧细胞细胞的 总mRNA,并反转录为cDNA作为检测样品，运用Real-timePCR方法进行检测，得出比-6的 表达水平，作为判断裸廳鼠IL-6基因表达发生改变的判断依据，具有良好的特异性和实用 性。
【附图说明】：
[0033] 图1是实施例1实时巧光定量PCR检测的烙解曲线；
[0034]图2是实施例1实时巧光定量PCR检测的扩增曲线；
[0035] 图3是实施例2中另外Ξ对引物化、c、d)和本发明中的引物序列（a)实时巧光定 量PCR检测的烙解曲线。
【具体实施方式】
[0036] 具体结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但本发明的实施并不仅限于 此。
[0037] 实施例1:
[0038] 根据GeneBank上裸廳鼠细胞因子IL-6基因的mRNA序列进行引物设计，引物序列 如下：
[0039]正向引物：5,-ACGCTAGTCCTCCACGAT-3,（沈QIDN0:1)
[0040]反向引物：5'-GGTTGTTTAACATTGCCTTT-3'（沈QIDN0:2)。
[0041] 具体检测步骤如下：
[0042] 1)提取mRNA:
[0043] 分离培养裸廳鼠巨隧细胞，A组为空白对照组，标记为1、2巧组为实验组，使用 病毒模拟物P〇lyI:C刺激巨隧细胞，标记为3-6。分别提取细胞总RNAaaKaRaRNAiso Plus)(TangXL,XinY,etal.MetabolicCharacteristicsandResponsetoHigh AltitudeinPhrynocephaluserythrurus(Lacertilia:Agamidae),aLizardDwellat AltitudesHigherThanAnyOtherLivingLizardsintheWorld.PLoSOne. 2013Aug7 ; 8(8):e71976.)，并反转录为cDNA(Fast如antRTKit(With曲化se)(KR106)，购自天根生 化科技有限公司）。
[0044] 2)制备实时巧光定量PCR反应体系lOul
[0045]取步骤 1)中cDNA模板 0. 8ul，2XSY