一种用Pax3基因检测皖东牛体型体重的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物学领域，特别是设及一种用化χ3基因检测晓东牛体型体重的方 法。
【背景技术】
[0002] 晓东牛是2015年通过农业部审定的牛的遗传资源，主要分布在安徽省东部沿江 淮分水岭丘陵地带，中屯、产区是凤阳、定远、明光、来安、五河等县（市）。据史料记载，晓东 牛养殖在当地至少有五百多年的历史，是沿江淮丘陵区农业生产的重要役畜。
[0003] 晓东牛体型中等偏大，躯干结实，毛色W黄色、深褐色为主，鼻镜多为黑色或肉色， 鼻孔周围为马蹄状白色；公牛头颈粗短，垂皮发达，蓄甲较高；母牛头颈细长、清秀，胸垂较 小；公母牛均有角，向前上方伸展，且多数角尖呈弧状向内弯曲；胸部宽深，前胸较发达，腰 背平直，腹大不下垂，尻部长度适中、较平直；四肢较细短，管骨细而结实，蹄质坚实，蹄壳多 为黄褐色；尾细，略超过飞节。母牛乳房发育较好，乳头粗长。
[0004] 晓东牛属肉役兼用型牛，在当地经长期选育，逐步形成了善爬坡、性情较溫顺、耐 粗饲和抗逆性强等特点。 阳〇化]体型大小是体现黄牛品种生产性能高低的重要指标，因此体型大小已成为一个重 要的问题。在晓东牛的长期自然选育和人工选育过程中，晓东牛体现出了肉役兼用的特点， 体型小的个体被淘汰，选育较大个体任是晓东牛肉用选育的重要目标。
[0006] 对调控牛体型大小的基因的多态性分析，目的在于探索其对黄牛肉用生产性状的 影响，为我国地方黄牛的肉用性能提升提供一定的理论依据。
[0007] 动物的生长发育主要是肌肉的生产，也是肉用的主要目标。肌肉细胞主要来自于 胚胎发育时的轴旁中胚层和侧中胚层两个部分。
[0008] 脊椎动物的胚胎发育期，轴旁中胚层形成W后随即裂为块状细胞团，所有的骨骼 肌都来自体节的生肌节区。生成骨骼肌的肌节间质细胞为呈双极形或纺键形的单核细胞， 运类细胞仍然能够进行DNA复制和细胞分裂，将进一步分化为成肌细胞。成肌细胞的仍是 单核细胞，但不进行DNA复制和有丝分裂，而是在生肌特异蛋白及其同工型的作用下，融合 形成肌管。肌管是多核细胞，其中含有由肌动蛋白和肌球蛋白组成的肌原纤维。细胞核位 居细胞的中央，随着肌原纤维的增多，细胞核向细胞的周边移动，运时的肌管就成为骨骼肌 细胞或称肌纤维。脊椎动物的肌肉组织在个体出生W后，肌纤维的数目不再改变。肌肉的 生长大多数依赖肌纤维长度增加和周径增大，而不是依赖于肌细胞数目的增多。
[0009] Pax基因是一个进化上比较保守的基因家族，该基因家族普遍存在于各种生物体 中。Pax基因家族有9个单独功能的基因。化x3基因主要分布于细胞核，是一类重要的转 录调控因子，其主要在胚胎发育过程中，对动物的组织和器官的分化形成起着重要的调控 作用。
[0010] Pax基因家族成员的主要功能是参与动物胚胎发生过程中细胞的分化和生长，Pax 家族中的化x3和化巧基因在小鼠肌肉发育过程中发挥重要作用，当化x3和化巧基因缺 失时会导致肌肉发育的停止，化x3和化巧基因是肌祖细胞和卫星细胞的重要调节和标记 基因，在脊椎动物的早期胚胎发育和后期肌肉生长、再生和修复过程中发挥重要作用。在动 物的躯干肌肉、神经脊细胞、背侧神经管W及体节形成的过程中，化巧可W取代化x3基因 发挥功能。然而在动物出生后的骨骼肌生长过程及在胚胎发育过程中肢体肌肉形成的过程 中，Pax3基因发挥重要的调节功能。
[0011] 综上所述，国内外的大量研究报道都证实了基因可W用来检测动物的外形特征， 鉴于此，申请人在化x3基因作为检测晓东牛胸围、管围和体重等指标的候选基因方面进行 了研究。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于，提供一种采用PCR-SSCP技术结合DNA测序的方法来检测牛的 化x3基因的序列，通过变异位点基因型的分析比较，从而预测和确定晓东牛的体型大小。 [001引本发明解决上述问题的技术方案如下：一种用化x3基因检测晓东牛体型体重的 方法，包括牛血液基因组提取、引物设计、PCR反应、PCR-SSCP分析和统计模型建立，其特征 在于，具体包括W下步骤：
[0014] (1)牛血液基因组提取：苯酪-氯仿提取法提取晓东牛全基因组DNA后利用TE缓 冲溶液溶解DNA，采用超微量分光光度计检测DNA浓度，最后稀释至50ng/μL存于-20°C备 用；
[00巧]似引物设计：根据牛化x3基因序列设计一对引物Pax上游引物和Pax下游引物， 其中：
[0016]Pax上游引物：5,-ATTGTCCCAGCCTGACCT-3,；
[0017]Pax下游引物：5, -GGATATTTGATATGTAGCCATG-3,；
[0018] (3)PCR反应：利用步骤似中设计的引物对牛的全基因组DNA进行PCR扩增，获 得牛化x3基因位于外显子2的359bp的片段，此区域为该基因的编码区；
[0019] (4)PCR-SSCP分析：扩增片段变性后，采用10%的聚丙締酷胺凝胶电泳后进行银 染和显色；SSCP分析后，纯化不同带型个体的PCR产物，分为Ξ种基因型，测序后发现位于 外显子2的1270bp处的T〉G碱基突变，分别命名为TT、TG和GG型；
[0020] (5)统计模型建立：根据牛群特点，建立固定模型，运用SPSS软件对数据进行分 析，将碱基突变位点与晓东牛体型体重性状进行关联分析，结果显示TT型和TG型的胸围、 管围、体重显著高于GG型，但在体高、体斜长、坐骨端宽方面差异不显著。
[0021] 优选地，步骤（3)中PCR反应条件为：94°C预变性5min;94°C变性30sec，54°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，35 个循环；72°C终延伸8min;4°C保存。
[0022] 优选地，步骤（3)中获得的位于外显子2的359bp的基因片段为晓东牛体型性状 选择的分子标记，为晓东牛生长发育的评定提供分子标记辅助选择。
[0023] 本发明用化x3基因检测晓东牛体型大小的方法，所带来的技术效果是：（1)通过 检测碱基的突变而分类的基因型；（2)其中用于分析基因多态性的部位是外显子；(3)其中 用于分析基因多态性的序列片段是由Pax上游引物和Pax下游引物表示的引物扩增的第一 外显子区域；（4)TT型和TG型的胸围、管围、体重显著高于GG型。
[0024]与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1)操作简单、费用低、精确度高，可进行 快速检测；（2)使用本发明的化x3基因型对晓东牛体型体重大小进行检测时，可决定晓东 牛的胸围、管围和体重；(3)对于培育肉用黄牛来说是一个极大的优势，而且可带来显著的 经济效益，为中国的养牛业带来广阔的发展前景和利润空间。
【附图说明】 阳02引 图1是晓东牛化x3基因外显子2的PCR扩增结果；
[0026] 图2是晓东牛化x3基因外显子2的PCR-SSCP结果；
[0027] 图3是晓东牛化x3基因变异序列测序图谱。
【具体实施方式】
[0028] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在W本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0029] 一、试验材料
[0030] 1、试验动物和性状测定
[0031] 选取384头18-36月龄健康晓东牛母牛，从牛的颈静脉采血511心置5mL肝素抗凝 采血管，轻微震荡混匀后，-20°C冻存备用。所采牛群来自凤阳县大明农牧科技发展有限公 司晓东牛保种场及定远和明光保种区。
[0032] 所有牛只测定性状包括：
[0033] 体斜长：从肩肿前缘到同侧坐骨结节后缘间的距离；
[0034] 体高：自響甲最高点到地面的垂直高度。
[0035] 胸围：在肩肿骨后缘处作一垂线，用卷尺饶一周测量。其松紧程度W能插入食指并 可上下滑动为宜。
[0036] 管围：前掌骨上1/3最细处的水平周长。
[0037] 体重：电子地磅实际称量牛的体重。 阳0測 2、药品和酶
[0039] 蛋白酶Κ，Ξ径甲基氨基甲烧（灯ris-Cl)，乙二氨四乙酸二钢脚TA)，化0H，无水 乙醇，漠酪蓝，二甲基苯氯FF，丙締酷胺，N，Ν' -亚甲双丙締酷胺度is)，硝酸银，去离子甲酯 胺，N，N，N，Ν' -四甲基乙二胺Ο?Μ邸），甲醒，琼脂糖，DNA聚合酶、dNTPsMix、DNAMarker I，漠化乙锭巧B)，过硫酸锭（AP)，PBS-缓冲液。 W40] 3、主要仪器
[0041] 基因扩增仪，冷冻高速离屯、机，凝胶成像系统，电泳槽，稳流稳压电泳仪，脱色摇 床，电子天平，超纯水仪，微波炉及移液器。 柳42] 二、试验方法
[0043] 1、试验所需试剂配制
[0044] (l)PBS-缓冲液：8g化C1、0. 2gKC1、1. 44g胞2册〇4、0. 24gKH2PO4,溶于 800血超 纯水中，用肥1调抑至7. 4,加水定容到比，高压灭菌，室溫保存。
[0045] (2) 5mol/L化0H:20g化0H溶于80血超纯水中，定容至100血，高压灭菌。
[0046](3)0. 5mol/L邸TA:邸TA186.Ig，溶于800血超纯水中，用化0H调抑至8. 0,定 容至lOOOmU高压灭菌，4°C避光保存。
[0047] (4)lmol/LTris-肥 1(抑8. 0) :121. 14gTris碱，溶于800血超纯水，盐酸调抑至 8. 0,定容至lOOOmU高压灭菌，4°C存放。 W48] 妨10%SDS:10gSDS溶于80血超纯水中，加热至68°C助溶，揽拌溶解，盐酸调抑 至7.2,定容至100血。
[0049] (6)70%乙醇：无水乙醇700111以加水300血。
[0050] (7)氯仿：异戊醇（24:1):异戊醇20血加入到480血的氯仿试剂瓶中，混匀。
[0051] (8)20mg/mLRNase:RNaseA溶于lOmmol/LTris-HCl(抑为8. 0)、15mmol/L化C1， 配成20mg/血浓度，70°C加热lOmin，纯化DM酶，-20°C保存。
[0052] 巧)DNA抽提缓冲液（S^?)