对柠檬酸杆菌017和o39特异的核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及对巧樣酸杆菌017和039血清型特异的核巧酸，尤其设及对巧樣酸杆 菌017和039血清型0抗原基因簇中单个基因特异的核巧酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 巧樣酸杆菌（Citrobacter)是肠杆菌科中一种常见的革兰氏阴性菌，通常能够利 用巧樣酸作为唯一的碳源，属于兼性厌氧菌。巧樣酸杆菌与沙口氏菌和大肠杆菌亲缘关系 最近，是一种条件致病菌。 巧樣酸杆菌通过DNA杂交的方法可分为11个基因种，分别为弗氏巧樣酸 杆菌杞化eundii)，科氏巧樣酸杆菌（C.koseri)，无丙二酸盐巧樣酸杆菌 (C.amalonatiz州S)，法氏巧樣酸杆菌（C.farmeri)，杨氏巧樣酸杆菌（C.youngae)，布 氏巧樣酸杆菌杞braakii)，沃克曼氏巧樣酸杆菌（C.werkmanii)，塞拉克氏巧樣酸杆菌 (C.sedlakif)，晒齿类巧樣酸杆菌（C.rodentium)，吉伦氏巧樣酸杆菌（C.gillenii)， 鼠类巧樣酸杆菌杞murliniae)，其中对人类具有明显致病性的是弗氏巧樣酸杆菌 (C.freundii)和科氏巧樣酸杆菌（C.koseri)。 弗氏巧樣酸杆菌能引起人的腹膜炎；科氏巧樣酸杆菌能在婴儿和免疫功能不全者中引 起脑膜炎、中枢神经系统脈肿和败血症，能引起老年人的呼吸道和尿道感染，还能引起皮肤 的感染等；其它一些巧樣酸杆菌可W在免疫抑制患者的腹腔内进行感染。此外，晒齿类巧樣 酸杆菌对人体无明显致病性，但是是小鼠的重要黏膜致病菌，其多个致病机制与肠道致病 性大肠杆菌（EPEC)和肠出血性大肠杆菌（E肥C)对人的致病机制相同，所W，晒齿类巧樣酸 杆菌对小鼠的致病常被用作研究EPEC和E肥C对人体致病的模型。 巧樣酸杆菌主要定植于人类和动物肠道中，也存在于±壤、水、污水、食物等环境中， 也能从消化道、尿液、血液和伤口中分离得到，也能从带有人类和动物粪便的环境中分离得 到。 细菌分型与鉴定方法主要有传统表型方法、血清学方法W及分子鉴定方法。然而，传统 的血清分型和鉴定方法存在着一定的局限性，如血清分型运种分型方法需要制备一系列特 异性抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，要得到特异性的抗血清比较麻烦，其制备 和储存都存在一些困难；另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不 同的0抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清 鉴定方法成为发展方向。 巧樣酸杆菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为巧樣酸杆菌菌种与株型鉴定的重 要依据，也因此产生了许多新的血清型。分子生物学检测技术具有速度快且易于大规模使 用的优点，是目前国际上公认的致病菌检测的发展方向，但当前的难点在于DNA祀标分子 特异性较低。细菌表面多糖抗原的多样性是由负责其合成的基因簇的遗传多样性导致的。 长期W来，人们一直试图探索巧樣酸杆菌的表面多糖抗原运一重要致病因子的多样性情况 及相应的遗传进化基础。但该研究方向上总体进展非常缓慢，针对其多糖抗原多样性和变 异规律方面的认识基本还是空白，例如：人们尚不了解巧樣酸杆菌中存在多少种表面多糖 抗原W及哪些表面多糖抗原对于该菌的致病性和流行性具有重要意义，负责其表面多糖抗 原合成的基因簇尚未被定位等。造成上述现象的主要原因是：多糖抗原合成基因簇组成复 杂、基因功能较难预、糖合成基因鉴定困难等。此外，已进行部分相关研究的单位大多缺乏 前期研究基础。 在本项目中，我们将在获得巧樣酸杆菌全部表面多糖抗原基因簇序列信息的基础上， 建立巧樣酸杆菌分子血清学分型系统和快速检测方法，具有重要的科学意义和较强的应用 价值。 近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转录间 隔区ατ巧序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态 性（RFL巧分析等。分子生物学方法不仅可用于巧樣酸杆菌的快速血清分型筛查，稳定的鉴 定结果可W弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，运些基于多聚酶链式反 应（PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、 特异性强等优点。 聚合酶链式反应技术（Polymerasechainreaction,简称PCR技术）作为微生物检 测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性 强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离屯、及裂解制备细 菌DNA模板，就可W在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是 否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。运对检验检疫部口 和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。不论从国内和国际的角度来看， 快速、准确地鉴定出血清类型，为巧樣酸杆菌的防控提供有效技术支持是十分重要的。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供了本发明设及对巧樣酸杆菌017和039血清型特异的核巧 酸，其特征在于所述的核巧酸具有： 1) 沈QIDNO: 1-4所示的核巧酸中的至少一种； 2) 与沈QIDNO: 1-4所示的核巧酸互补的核巧酸，即沈QIDNO:5-8中的至少一种； 所述的沈QIDNO: 1-4如下：
所述的沈QIDNO:5-8如下：
本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DM聚合酶，所述PCR引物为如SEQIDNO: 1-4所示的核巧酸中的至少一对引物。所述的试剂盒，还包括如下试 剂：10mldNTP30μ1 ;10X酶特异性反应缓冲液50μ1 ;5U/μ1耐热DNA聚合酶5μ1 ; 引物混合物10μ1 ;阳性对照品10μ1;阴性对照品10μ1 ;(1地2〇 5ml。其中所述的PCR 引物优选为所述如SEQIDNO: 1-4所示的核巧酸中的至少一种。 本发明进一步公开了对巧樣酸杆菌017和039血清型特异的SEQIDNO: 1-4核巧酸在 制备用于检测巧樣酸杆菌017和039血清型的PCR试剂盒方面的应用。本发明所述巧樣酸 杆菌可W取样于消化道、尿液、血液和伤口培养物的粗提液，或者是人类和动物粪便环境培 养物得到的粗提液等。收集巧樣酸杆菌提取基因组是采用常规方法制备获得。 针对巧樣酸杆菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理一扩增一电泳检测结 果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样 本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。 本发明公开的对巧樣酸杆菌017和039血清型特异的核巧酸与现有技术相比，本发明 具有如下优点： (1) 实用性强 本发明建立的一种PCR反应体系，可检测巧樣酸杆菌，提供血清分型检测所用到的特 异引物，利用该PCR方法可W对临床标本进行检测。 (2) 准确性高 本发明通过对巧樣酸杆菌的各血清型特异的基因的PCR反应，每个样品得到一条目的 条带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可W得到巧樣酸杆菌所属的血清型。 (3) 检测成本相对较低 可W推广应用于食品卫生监督、环境监测、尚品监测检验检疫等领域，并为其他不同致 病菌检测组合提供技术模式。
[0004]【附图说明】： 图1表示本发明017血清型基因P1和P2引物检测巧樣酸杆菌和其他血清型标准 菌株电泳结果图，基因P1和P2引物的筛选，目的条带为327bp，其余的血清型没有任 何条带，具体菌株信息见表3 ; 图2表示本发明017血清型基因P1和P2引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中 检测了 4株弧菌W及1株沙口菌、