一种鸡下丘脑和卵巢基因表达相对定量的检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及动物遗传学，提供了一种鸡下丘脑和卵巢基因表达相对定量的检测方 法及其应用。
【背景技术】
[0002] 实时巧光定量反转录PCR(real-timefluorescentquantitativereverse transcriptionpolymerasechainreaction,RT-qPCR)已广泛应用于基因表达方面的研 究。在RT-qPCR应用中，由于不同样品间RNA的质量、起始量、cDNA合成效率W及PCR反应 扩增效率等的差别，会影响目标基因表达差异的准确性，因此，需要引入适合的内参基因给 予校正，常用的内参基因一般是持家基因，比如：18S核糖体RNA基因（18SrRNA)、beta-肌 动蛋白基因（P-actin，ACTB)和3-憐酸甘油醒脱氨酶基因（GAPDH)等。但是，近年来的研 究发现，运些常用内参基因在不同类型细胞、不同组织器官、各种不同的实验处理条件W及 相同组织不同的发育阶段等各种情况下，它们的表达量并不总是恒定的，甚至变异很大，至 今尚未发现在所有条件下都恒定表达的持家基因。因此，在特定目标基因表达研究中对候 选内参基因的表达稳定性进行评价，筛选出最为稳定的内参基因，是保证研究结果真实、可 靠的关键。
[0003] 家禽的繁殖性状受下丘脑-垂体-性腺的相互调节，其中下丘脑是繁殖活动的直 接调节中枢，性腺作为下级中枢又可反作用于下丘脑。有许多激素和生长因子等相关基因 参与运一复杂调控系统。下丘脑-垂体-性腺轴上基因的表达调控对鸡性成熟及繁殖性状 有着重要影响，内参基因的稳定性是影响性腺轴上目标基因表达定量可信度的关键因素。 然而，常用内参基因在发育不同阶段鸡下丘脑和卵巢组织中的表达稳定性尚未得到确认。
【发明内容】
[0004] 本发明的发明人在上述技术背景下，提供了一种鸡下丘脑和卵巢基因相对表达的 检测方法及其应用，具体采用RT-qPCR方法进行检测，检测的目标基因为卵巢中首选内参 基因为β-actin，在下丘脑中为GAPDH;发明人确定上述两种内参基因后，W此为基础可W 为鸡性成熟及繁殖性状相关功能基因的筛选及其作用机理检测的准确性提供有力保障，从 而有助于进一步挖掘运些功能基因有意义的分子标记用于鸡高繁、早熟新品种的培育。
[0005] 本发明W性成熟发育不同阶段的济宁百日鸡为实验材料，利用实时巧光定量 RT-PCR检测常用的3个持家基因β-actin、GAPDH和18SrRNAW及一个目标功能基因 GnRN-1在下丘脑W及卵巢组织中的表达，利用geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件比 较3个持家基因表达稳定性，并用GnRN-1基因进行印证。结果表明：在性成熟发育不同阶 段的济宁百日鸡下丘脑中，表达最为稳定的是GAPDH基因，而在卵巢中表现最为稳定的是 β-actin基因，因此可上述两种持家基因作为鸡下丘脑和卵巢基因相对表达的内参基 因。
[0006] 在确定上述两种内参基因后，发明人进一步提供了鸡下丘脑和卵巢基因相对表达 的检测方法，具体采用RT-qPCR方法进行检测，具体步骤如下：
[0007] 引物的设计，具体如下：
[0008]GAPDHF-TCACAGCCACACAGAAGACG，其核巧酸序列如沈QNO. 1 所示，
[0009]R-ACTTTCCCCACAGCCTTAGC，其核巧酸序列如沈QNO. 2 所示，
[0010]ACTBF-TGGATGATGATATTGCTGC，其核巧酸序列如沈QNO. 3 所示，
[0011]R-ATCTTCTCCATATCATCCC，其核巧酸序列如沈QNO. 4 所示；
[001引RNA的提取和cDNA的合成；
[0013]RT-qPCR的检测；
[0014] 之后利用2ΔCt=各样本Ct值-最小Ct值）方法计算各基因表达的相对 定量数据。
[0015] 在获得上述数据之后，发明人进一步利用GnRN-1基因进行印证，证实结果真实可 靠，因此可W此为基础可W为鸡性成熟及繁殖性状相关功能基因的筛选及其作用机理检测 的准确性提供有力保障，从而有助于进一步挖掘运些功能基因有意义的分子标记用于鸡高 繁、早熟新品种的培育。
【附图说明】
[0016] 图1为各内参基因在下丘脑和卵巢组织中Ct值比较图；
[0017] 图2为卵巢中各内参基因在不同时期各样本的Ct值趋势图；
[0018]图3为下丘脑中各内参基因在不同时期所有样本的Ct值趋势图，
[0019] 图1-3中发明人分别对Ξ个内参基因在3(M、6(M、9(M、100d、ll(M、140d开产和未 开产7个不同发育时期下丘脑及卵巢组织中，所有样本的Ct值变化趋势进行分析，结果表 明，运些内参基因的Ct值高低变化在两种组织中均没有呈现出一定规律，但不同基因间Ct 值最大值（max)和最小值（min)(见实施例中表2,表3)的差值大小（极差）存在差异，表 现为不同基因Ct值变化曲线的平滑度存在差异（如图2,图3所示），运个差值越大，说明 该基因在各个样本间表达的均一程度越差，在卵巢中各基因极差值由小到大为18SrRNA(3 .79)<GAPDH(4. 29)<ACTB(4. 37)，在下丘脑中各基因极差值由小到大为18SrRNA(l. 85)<GA PDH(2. 76)<ACTB(3. 89)，但无论在下丘脑还是卵巢组织，ACTB的Ct值极差均表现为最大；
[0020] 图4为geNorm软件分析内参基因在发育不同阶段下丘脑和卵巢组织中表达稳定 性Μ值结果显示图，
[0021] 由图4可知，Ξ个内参基因的表达稳定性从大到小排序为：下丘脑中 GAPDH(0. 599)〉ACTB(0. 710)〉18SrRNAO). 789);卵巢中ACTB(1. 070)〉GAPDH(1. 292)〉18S rRNA(l. 395)。说明不同发育时期济宁百日鸡的下丘脑中GAPDH表达稳定性最好，而在卵巢 中ACTB的表达最为稳定；
[0022] 图5为NormFinder软件分析内参基因在发育不同阶段下丘脑和卵巢组织中的表 达稳定值结果显示图，
[0023] 由图可知在下丘脑中3个内参基因的稳定性从小到大为GAPDH0). 161)〉ACTB〇). 226)〉18S '歷姑2喊，而卵巢中稳定值从小到大是4(册姑342)乂4口0!1〇).517)〉185诚酷(0.573)，说明 下丘脑和卵巢中表达稳定性最好的分别是GAPDH和ACTB,运与geNorm的分析结果一致；
[0024]图6为不同内参时GnRH-1基因在不同发育时期济宁百日鸡下丘脑中的表达结果 柱状图，
[00巧]图中Ξ个内参基因均显示了GnRH-1在7个不同发育时期相同的表达趋势，但差异 显著性的检出存在差异，WACTB为内参时（图6A)，140a和14化与3(M、9(M、110d差异显 著（P= 0. 0229);WGAPDH为内参时（图她），除检测出 140a和 140b与 30(1、90(1、110(1差 异显著外还检出60d与运3个时期也存在显著差异（P= 0. 0075);而W18SrRNA为内参 基因时（图6C)，未达到统计意义上的差异显著（P= 0. 0503);
[0026] 图7为不同内参时GnRH-1基因在不同发育时期济宁百日鸡卵巢中的表达结果柱 状图，
[0027] 图中Ξ个内参基因均显示了GnRH-1在7个不同发育时期相同的表达趋势，WACTB 为内参时（图7A)，60和140日龄未开产（140a)GnRH-l基因mRNA表达量与30、90、110、140开产（140b)日龄差异显著（p= 0. 0122);WGAPDH为内参时（图7B)，仅检测到60日龄的 表达量与90、110、140开产（140b)差异显著，未检测出60日龄与30日龄的差异，化及140 日龄开产与未开产（140a与14化）的差异（P= 0.0451) 18SrRNA为内参时，仅检测到 140日龄开产与未开产（140a与14化）的差异（P= 0.0005);
[002引图6和图7中含有不相同小写字母为差异显著（p<0. 05)，含有不相同大写字母为 差异极显著（P<0.01)。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1.内参基因的确定
[0030] 1.实验材料
[0031] 随机选取3(M、6(M、9(M、lOOd、11(M、140d开产和未开产济宁百日鸡各4只，颈静脉 放血处死后取下丘脑和卵巢组织，迅速投入液氮并保存，用于RNA提取。
[00础 2.实验方法
[0033] 2. 1RNA的提取和cDNA的合成
[0034] 不同发育阶段的济宁百日鸡下丘脑和卵巢的总RNA采用RNA提取试剂盒 (Qiangen，USA)进行提取，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并用紫外分光光度计 分析总RNA浓度和纯度，A260/280 = 1. 8~2. 0,RNA于-80°C保存备用。依据TAKARA反转 录试剂盒说明书，取lug总RNA，W01ig〇-dT18为引物，完成一链cDNA的合成，所得反转录 产物于-20°C保存。
[0035] 2.2引物设计及合成
[0036]根据GenBank上鸡的基因组参考序列GAPDH(N〇:NM_204305.1)、Α(：ΙΒ(Νο:?)81 肪 1)、18S rRNA(No:M59389.1)和目标功能基因GnRH-l(No:NM_001080877. 1)的mRNA序列，在各自跨外显子 区域设计特异的用于巧光定量PCR的引物（引物信息见表1)，所有引物序列均由上海生物 工程有限公司合成。
[0037] 表1.内参基因引物序列及相关?目息
[0038]
[0039] 2. 3实时巧光定量PCR
[0040] 实时巧光定量PCR灯R-qPCR)反应在StratageneMx3000P巧光定量PCR仪上，按 照化kara的SYBRpremixEx化q?II试剂盒说明书进行，模板、引物浓度及退火溫度等经 过摸索获得最佳反应条件如下：PCR反应体系为15μL包括按1 :5倍稀释的cDNA模板（18S rRNA按 1:125) 1.5 上下游引物各 0.2yL2xSYBRPremixExTaqTMBuffer7.加1， RoxIIO. 3μL(1地2〇 补足至 15μL;PCR反应程序为 95°C预变性lOmin;95°C变性 30s，56°C 退火30s，72°C延伸25s;在延伸阶段收集巧光信号强度，共35个循环。烙解曲线分析：95°C Imin;60°C30s，95°C，30s，58~95°C每个循环全程采集巧光信号1次。每个cDNA样品