均设 3个复孔，仪器自带软件自动生成标准曲线和烙解曲线，各个基因的溶解曲线均表现为单一 峰，说明内参基因引物特异性好，无引物二聚体和非特异条带扩增。
[0041] Mx3000p自动生成目的基因和内参基因的Ct值，并据此计算2AAEt值。运就要 求目的基因与内参基因的扩增效率应该基本一致，此要求是通过分别制作目的基因与内参 基因的标准曲线来实现。通过对模板浓度及倍比稀释倍数的摸索，最终确定将cDNA模板从 初始浓度按5倍倍比依次稀释5个梯度，用于标准曲线的cDNA浓度分别为1 (初始浓度）， 1/5,1/25,1/125,1/625。由此获得各个内参基因标准曲线的相关系数变化范围为0. 996~ 0. 998,根据标准曲线计算的扩增效率为97. 3~100. 8%。
[0042] 2. 4数据分析
[004引用2Att(ΔCt=各样本Ct值-最小Ct值）方法计算各基因表达的相对定量数 据，用R、geNorm、NormFinder和BestKe巧er软件对3个内参基因在济宁百日鸡不同发育时 期下丘脑和卵巢中的Ct值变化趋势W及表达稳定性进行统计分析。2AAEt法分析目标基 因GnRH-1的相对表达（具体见实施例2)。
[0044] 3.结果判定
[0045] 3. 1内参基因Ct值比较
[0046] RT-qPCR中，Ct值的大小反应了基因表达的丰度，Ct值越小基因表量达越高，反 之，Ct值越大，表明基因表达量越低。Ξ个内参基因的Ct值比较表明，每个内参基因在鸡 性成熟发育过程中下丘脑和卵巢组织的表达水平均有一定的变化。如图1所示，在卵巢中 ACTB的Ct值最小（中位数=17. 01)，表明其表达量最高，18SrRNA(125倍稀释）和GAPDH 两个基因表达量相对偏低（中位数分别=17. 77,17. 86)，而在下丘脑组织中，18SrRNA的 Ct值最小（中位数=16. 83)，说明其在下丘脑中表达丰度最高，其次是GAPDH(中位数= 19. 85)，ACTB表达量最低（中位数=20. 44)。运表明Ξ个内参基因在鸡卵巢和下丘脑中的 表达量存在着组织差异。
[0047] 分别对Ξ个内参基因在30d、60d、90d、100d、110d、140d开产和未开产7个不同发 育时期下丘脑及卵巢组织中，所有样本的Ct值变化趋势进行分析，结果表明，运些内参基 因的ct值高低变化在两种组织中均没有呈现出一定规律，但不同基因间Ct值最大值（max) 和最小值（min)(见表2,表3)的差值大小（极差）存在差异，表现为不同基因Ct值变化曲 线的平滑度存在差异（图2,图3)，运个差值越大，说明该基因在各个样本间表达的均一程 度越差，在卵巢中各基因极差值由小到大为18SrRNA化79)<GAPDH(4. 29)<ACTB(4. 37)，在 下丘脑中各基因极差值由小到大为18SrRNA(1. 85) <GAPDH化76) <ACTB化89)，但无论在 下丘脑还是卵巢组织，ACTB的Ct值极差均表现为最大。
[0048] 3. 2geNorm软件分析
[0049] 通过2-AU算法将RT-qPCR得到的Ct值转换成对应的表达量并输入geNorm程 序，然后计算基因表达稳定度Μ值，并对内参基因的表达稳定度进行排序，Μ值越小，基因 表达越稳定。结果由图4可知，Ξ个内参基因的表达稳定性从大到小排序为：下丘脑中 GAPDH(0. 599)〉ACTB(0. 710)〉18SrRNAO). 789);卵巢中ACTB(1. 070)〉GAPDH(1. 292)〉18S rRNA(1.395)。说明不同发育时期济宁百日鸡的下丘脑中GAPDH表达稳定性最好，而在卵巢 中ACTB的表达最为稳定。
[0050] 3. 3NormFinder软件分析
[0051]NormFinder是一个MicrosoftExcel加载宏，运行原理与geNorm相似，适用于所 有样品候选内参基因表达稳定性排序，排在最上面的稳定值越小的基因表达最稳定。分析 内参基因在不同发育阶段济宁百日鸡下丘脑、卵巢组织中的表达稳定性，结果表明，在下丘 脑中3个内参基因的稳定性从小到大为GAPDH(0. 161)〉ACTB(0. 226)〉18SrRNA(0. 265)，而 卵巢中稳定值从小到大是ACTB(0. 342)〉GAPDH(0. 517)〉18SrRNA(0. 573)，比较结果如图5 所示，说明下丘脑和卵巢中表达稳定性最好的分别是GAPMl和ACTB,运与geNorm的分析结 果一致。
[0052] 3.4 Bestkeeper软件分析
[0053]Bestke巧er软件在每个基因中直接产生配对相关系数和Bestke巧er指数，指数 的产生是由所有内参基因Ct值的几何平均数（GM)产生。主要W标准变异系数（SD)和变 异相关系数（CV)来判断基因表达的稳定性，SD和CV的值越小，表明基因表达越稳定。从 表2的参数信息可W看出，在卵巢中表达最稳定的内参基因是ACTB，其次是18SrRNA，最不 稳定的是GAPDH，而内参基因18SrRNA在济宁百日鸡下丘脑中表达最稳定，其次是GAPDH， 相比而言ACTB最不稳定（参数信息见表3)。
[0054] 表2.Bestkeeper分析内参基因在济宁百日鸡卵巢中的表达稳定性相关参数
[00巧]
[0057] 表3.Bestke巧er分析内参基因在济宁百日鸡下丘脑中的表达稳定性相关参数
[0058]
[0059] 综上所述：本研究通过分析GAPDH、0 -actin和18SrRNAΞ个常用的内参基因在 鸡性成熟发育不同阶段下丘脑和卵巢组织中的表达稳定性，发现，在鸡性成熟发育不同阶 段的卵巢中最稳定的内参基因为P-actin(ACTB)，而在下丘脑中为GAPDH。也即在进行目 标基因表达研究时卵巢中首选内参基因为β-actin，下丘脑中为GAPDH。
[0060] 实施例2.应用内参基因检测鸡下丘脑和卵巢中目标功能基因相对表达的方法
[0061] 2. 1鸡下丘脑和卵巢目标基因相对表达的检测方法
[0062] GnRH-1是由下丘脑分泌的调控动物性成熟启动的关键功能基因，在哺乳动物中 研究发现其在性腺和其它脑外组织也均有表达。在鸡的性成熟发育过程中，GnRH-1基因 在下丘脑和卵巢组织中的表达特征尚未见报道。本实施例采用上述筛选出的内参基因结 合采用巧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析其在鸡不同时期组织中的表达特征，为进一步研 究GnRH-1基因在卵巢中的作用机制提供依据。所用实验材料及实验方法均同实施例1。 GnRH-1引物信息如下巧'一 3' ):F-GGCTCAACACTGGTCTTATGG，其核巧酸序列如沈QNO. 7 所示，R-TCTTCTGGCTTCTCCTTCG，其核巧酸序列如沈QNO. 8所示；
[0063] 2. 2数据分析
[0064]MX3000P定量PCR仪自动生成目标基因和内参基因的ct值，W目标基因ct值-内 参基因ct值，并据此计算2AAEt值。数据统计采用SAS8. 1统计软件包的GLM程序进行目 标基因分别W3个不同持家基因作为内参时在不同发育时期卵巢和下丘脑表达量的相关 分析。
[0065] 2. 3结果判定
[0066] 2. 3. 1GnRH-1基因在下丘脑的表达谱
[0067]分别WGAPDH、β-actin和 18SrRNA为内参基因，分析GnRH-1 在 30d、60d、90d、 100d、ll(M、140d开产和未开产（140a和140b)济宁百日鸡下丘脑中的表达变化，结果如图 6所示，Ξ个内参基因均显示了GnRH-1在7个不同发育时期相同的表达趋势，但差异显著性 的检出存在差异，WACTB为内参时（图6A)，140a和14化与3(M、9(M、110d差异显著（P= 0. 0229)。WGAPDH为内参时（图她），除检测出140a和14化与3(M、9(M、110d差异显著 外还检出60d与运3个时期也存在显著差异（P= 0. 0075)。而W18SrRNA为内参基因时 (图60,未达到统计意义上的差异显著（p= 0.0503)。可见卵巢中内参基因Wβ-actin 为最佳。
[0068] 2. 3. 2GnRH-1基因在卵巢中的表达谱
[0069]分别WGAPDH、β-actin和 18SrRNA为内参基因，分析GnRH-1 在 30、60、90、100、 110、140(开产140a和未开产14化）日龄时济宁百日鸡卵巢中的表达变化，结果如图7所 示，Ξ个内参基因均显示了GnRH-1在7个不同发育时期相同的表达趋势，WACTB为内参 时（图7A)，60和140日龄未开产（140a)GnRH-l基因mRNA表达量与30、90、110、140开产 (140b)日龄差异显著（p= 0. 0122)。WGAPDH为内参时（图7B)，仅检测到60日龄的表达 量与90、110、140开产（140b)差异显著，未检测出60日龄与30日龄的差异，化及140日龄 开产与未开产（140a与14化）的差异（P= 0. 0451)。W18SrRNA为内参时，仅检测到140 日龄开产与未开产（140a与14化）的差异（p= 0.0005)。可见下丘脑中内参基因WGAPDH 为最佳。
【主权项】
1. 一种鸡下丘脑和卵巢基因表达相对定量的检测方法，其特征在于：所检测的目标基 因为卵巢中首选内参基因为β-actin，在下丘脑中为GAPDH。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所采用的内参基因引物分别为： GAPDHF-TCACAGCCACACAGAAGACG，其核苷酸序列如SEQNO. 1 所示， R-ACTTTCCCCACAGCCTTAGC，其核苷酸序列如SEQNO. 2 所示， ACTBF-TGGATGATGATATTGCTGC，其核苷酸序列如SEQNO. 3 所示，R-ATCTTCTCCATATCATCCC，其核苷酸序列如SEQNO. 4 所示。
【专利摘要】本发明涉及动物遗传学，提供了一种鸡下丘脑和卵巢基因相对表达的检测方法，具体采用RT-qPCR方法进行检测，检测的目标基因为卵巢中首选内参基因为β-act？in，在下丘脑中为GAPDH；发明人确定上述两种内参基因后，以此为基础可以为鸡性成熟及繁殖性状相关功能基因的筛选及其作用机制判定的准确性提供有力保障，从而有助于进一步挖掘这些功能基因有意义的分子标记用于鸡高繁、早熟新品种的培育。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105256027
【申请号】CN201510681493
【发明人】康丽, 陈秋月, 袁振杰, 姜运良, 曹顶国, 周艳
【申请人】山东农业大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月19日