细胞周期蛋白g1作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于电离辐射生物剂量计，具体涉及细胞周期蛋白G1(cyclin?G1，CCNG1)基因作为电离辐射生物剂量计的应用。人淋巴母细胞受到低剂量电离辐射后，以及哺乳动物辐射后外周血淋巴细胞的CCNG1基因mRNA水平表达的增加与受到的电离辐射剂量成正比，存在一定的剂量-效应关系，于照射后24h和48h采用实时荧光定量PCR法即可快速简便地定量检测，因此，CCNG1可作为低剂量电离辐射范围的生物剂量计，可以采用CCNG1基因表达定量分析法对人体和哺乳动物受到低剂量电离辐射的剂量大小进行评估。
【专利说明】细胞周期蛋白G1作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用
1【技术领域】
[0001]本发明属于低剂量电离福射生物剂量计,具体涉及细胞周期蛋白Gl (cyclin Gl,CCNG1)作为低剂量范围电离辐射生物剂量计的应用。
2【背景技术】
[0002]低剂量电离辐射暴露的人群和几率远比大剂量照射事件或事故大，如天然本底辐射、频繁的飞行活动、医学检查、不适当的居住环境、职业照射和空间活动等。低剂量电离辐射虽不足以引起临床可见的损伤，但对低剂量暴露人群若不及时采取监测、危害评价和防护措施，会对暴露人员带来远后效应的健康危害，还可能造成人员严重的心理损害等。作为辐射损伤救治和危害评价的重要依据，辐射剂量的准确估算对诊断和治疗有重要的指导作用。目前，辐射生物剂量计的研究已有了长足的发展，但在临床应用中仍存在耗时长、费用高、专业技术要求高等问题，且主要应用范围为较高剂量的辐射损伤。近年来，国内外相关实验室开展了一些新型生物剂量计的研究，也报道了适用于低剂量辐射的生物标志物，但主要采用的是数个基因的联合应用。迄今为止，这些研究尚处于探索阶段，因此，有必要寻找新型、快速、可靠的低剂量电离辐射生物剂量指标。[0003]CCNGl是细胞周期蛋白(cyclin)家族的重要成员，定位于5号染色体q32，编码产物为含366个氨基酸的蛋白质，其N端有一个典型的细胞周期蛋白盒，C端有一段与人表皮生长因子受体酪氨酸磷酸化位点同源的序列。CCNGl是唯一受肿瘤抑制基因p53调控的细胞周期蛋白，其启动子内部包括2个p53的结合位点，对细胞周期进程起负调控作用，在细胞增殖、DNA修复中起作用，参与细胞DNA损伤后的G2 / M期阻滞与凋亡。CCNGl也是最早被发现为P53的靶基因之一，是p53-Mdm2网络中的关键调控因子。有研究报道了 CCNGl在ATM依赖的p53调控和DNA损伤时细胞周期调节中的重要作用，认为CCNGl缺乏可增加P53的聚集，使p53在Ser-15位点磷酸化，进而导致细胞周期阻滞，而CCNGl介导的p53调控依赖于ATM(ataxia_telangiectasia mutated)蛋白的状态，CCNGl异位表达可显著减少受到DNA损伤时含有ATM的正常人皮肤成纤维细胞稳定态p53和Ser_15位点的p53磷酸化。Seo HR等人研究报道CCNGl通过上调细胞周期蛋白BI (cyclin BI)对抗电离辐射诱导的G2期阻滞进而增加细胞的辐射敏感性[1°]。常公民等采用3.0Gy中子照射小鼠，发现小鼠骨髓细胞CCNGl基因表达明显上调，认为CCNGl可能是中子辐射致骨髓损伤的敏感靶基因之一。
3
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供细胞周期蛋白Gl (cyclin G1,CCNG1)作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用。
[0005]为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:细胞周期蛋白Gl作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用。
[0006]一种检测人或动物所受低剂量范围辐射剂量的方法，包括如下步骤:[0007] (1)按照常规方法培养细胞，将细胞置于已知辐射强度的环境中接受辐射，照后在三个以上时间点收集辐射后细胞，定量检测其细胞周期蛋白Gl的mRNA表达水平，获得该细胞受到的电离辐射剂量和B细胞转位基因2表达水平关系的标准曲线；
[0008](2)分离并收集接受了待测剂量辐射的动物外周血淋巴细胞，测定其中的细胞周期蛋白Gl的mRNA表达水平，根据步骤(1)获得的标准曲线计算得到该动物所受到的电离福射剂量。
[0009]上述技术方案中，待测细胞可来自细胞株，如人淋巴母细胞，也可来自人或动物的组织细胞，如外周血淋巴细胞。
[0010]上述技术方案中，测定细胞中细胞周期蛋白Gl的表达水平的方法是:采用实时荧光定量PCR法测定细胞中细胞周期蛋白Gl的mRNA表达水平。
[0011]由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有以下优点:
[0012]由于细胞株或动物受到低剂量电离辐射后，其中CCNGl含量的增加与受到的电离辐射剂量正相关，存在一定的剂量-效应关系，且于照射后24h即可采用简便易行、定量准确、敏感度高的方法进行快速检测，因此，CCNGl可作为低剂量电离辐射生物剂量计，定量检测人或动物受到低剂量电离辐射。
4【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为实施例一中指数生长期的AHH-1细胞经不同剂量137Cs Y射线照射后CCNGl基因表达量随时间变化图；
[0014]图2为实施例一中指数生长期的AHH-1细胞经不同剂量137Cs Y射线照射后24小时CCNGl基因表达量的剂量-效应曲线；
[0015]图3为实施例一中指数生长期的AHH-1细胞经不同剂量137Cs Y射线照射后48小时CCNGl基因表达量的剂量-效应曲线；
[0016]表1为实施例二中不同剂量6tlCoy射线诱导动物外周血淋巴细胞中CCNGl基因表达变化。
5【具体实施方式】
[0017]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
[0018]实施例一:不同低剂量电离辐射人淋巴母细胞中CCNGl基因表达的剂量-效应关系
[0019]1.材料:人淋巴母细胞(AHH-1)由第二军医大学防原医学教研室惠赠；TRlzolreagent 和 M-MLV 反转录酶为 Invitrogen 公司产品；SYBR Premix Ex Taq 为 Takara 公司
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[0020]2.细胞培养细胞培养于含10 %小牛血清，谷氨酰胺及100万U / L青霉素和链霉素的RPMI1640培养基。细胞置于37°C、5% C02孵箱中培养，2~3天传代I次，取对数生长期细胞用于辐照。
[0021]3.福照:复旦大学放射医学研究所，Gamma cell40, 137Cs (N0RD10N InternationalInc.CANADA)，剂量率为 0.162Gy / min，剂量为 0，0.1，0.2，0.5，0.8，1.0Gy。
[0022]4.Real-time PCR法测定人淋巴母细胞中CCNGl基因表达的量:[0023]4.1总RNA抽提及cDNA合成:实验组经照射后和未照射对照组细胞置于37°C、5% C02孵箱中继续培养他，411，2411，4811，7211，16811，随后每组样品取IXlO6细胞，加ImlTRIzol，裂解后提取总RNA，Nanodrop ND-1000检测样品RNA浓度和纯度，进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。用Invitrogen公司的M-MLV反转录酶对抽提的人淋巴母细胞总RNA进行cDNA逆转录合成，逆转录总体积为20ul，总RNA为lug，引物为OIigo (dT) 18,具体操作依据产品说明书。
[0024]4.2引物设计:依据NCBI数据库中的β-actin和CCNGl基因序列，用Primerpremier5软件设计实时荧光定量PCR的相应引物，由上海捷瑞生物工程有限公司(GENEray)合成。
[0025]4.3实时荧光定量PCR:采用SYBR实时荧光定量PCR方法，用Chromo4(BIO-RAD公司)实时荧光PCR检测仪，按照用户手册操作。PCR反应程序为:95°C 3min ；95°C IOs ；60°C 30s ;共40个循环。每个样品重复做3个平行样，每次反应结束后进行熔解曲线分析，排除非特异性PCR产物的影响。以β-actin为内参，同时设置空白对照组。
[0026]4.4定量方法和统计分析:采用相对定量法，以看家基因β -actin为内参，采用MJOptionMonitorAnalysis Software V3.1 和 Exc el 软件对结果进行分析。
[0027]如图1所示，照射后24h，与未照射组比较，0.1Gy照射组CCNGl基因上调2.01倍，
0.2Gy照射组CCNGl基因上调2.35倍，0.5Gy照射组CCNGl基因上调3.16倍，0.8Gy照射组CCNGl基因上调3.51倍，1.0Gy照射组CCNGl基因上调4.32倍；照射后48h，与未照射组比较，0.1Gy照射组CCNGl基因上调1.66倍，0.2Gy照射组CCNGl基因上调2.11倍，0.5Gy照射组CCNGl基因上调2.41倍，0.8Gy照射组CCNGl基因上调2.78倍，1.0Gy照射组CCNGl基因上调3.32倍。
[0028]结果表明，低剂量电离辐射后24h，受照细胞CCNGl基因表达上调，并随照射剂量增加而增加，与照射剂量正相关，呈现出一定的剂量-效应关系(图2)，拟合剂量-效应曲线方程为:y=2.8205X+1.5028，R2=0.9274。随着时间的延长，受照细胞CCNGl基因表达开始下调，在72h时已接近正常，但在48h时仍显著高于未照射组，并与照射剂量正相关，呈现出一定的剂量-效应关系(图3)，拟合剂量-效应曲线方程分别为:y=1.941x+1.373，R2=0.911。其中Y为CCNGl基因在mRNA水平的相对表达量，X为照射剂量(Gy)。
[0029]实施例二:不同低剂量电离辐射Balb / c小鼠外周血淋巴细胞中CCNGl基因表达的剂量-效应关系
[0030]1.材料:肝素钠；小鼠淋巴细胞分离液为达科为生物技术有限公司产品；TRlzolreagent 和 M-MLV 反转录酶为 Invitrogen 公司产品；SYBR Premix Ex Taq 为 Takara 公司产品。
[0031]2.动物分组及处理:20只雄性Balb / c小鼠，体重20 ±2g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。动物随机分为4组，分别为未照射组、0.1Gy照射组、0.5Gy照射组和
1.0Gy照射组，每组5只。各照射组在海军医学研究所辐照室进行照射，放射源为6°Co，单次照射，剂量率为0.5Gy / h。
[0032]3.分离淋巴细胞:于照射结束后24h，收集照射组和未照射组小鼠的抗凝血，分离淋巴细胞，具体操作依据说明书的操作步骤。
[0033]4.Real-time PCR法测定小鼠外周血淋巴细胞中CCNGl基因表达的量:[0034]4.1总RNA抽提及cDNA合成:取I X IO6细胞，加Iml TRIzol，裂解后提取总RNA，Nanodrop ND-1000检测样品RNA浓度和纯度，进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。用Invitrogen公司的M-MLV反转录酶对抽提的外周血淋巴细胞总RNA进行cDNA逆转录合成，逆转录总体积为20ul，总RNA为lug，引物为OIigo (dT) 18，具体操作依据产品说明书。
[0035]4.2引物设计:依据NCBI数据库中的β-actin和CCNGl基因序列，用Primerpremier5软件设计实时荧光定量PCR的相应引物，由上海捷瑞生物工程有限公司(GENEray)合成。
[0036]4.3实时荧光定量PCR:采用SYBR实时荧光定量PCR方法，用Chromo4(BIO-RAD公司)实时荧光PCR检测仪，按照用户手册操作。PCR反应程序为:95°C 3min ；95°C IOs ；60°C 30s ;共40个循环。每个样品重复做3个平行样，每次反应结束后进行熔解曲线分析，排除非特异性PCR产物的影响。以β-actin为内参，同时设置空白对照组。
[0037]4.4定量方法和统计分析:采用相对定量法，以看家基因β -actin为内参，采用MJOptionMonitorAnalysis Software V3.1 和 Exc el 软件对结果进行分析。
[0038]如表1所示，照射后24h，与未照射组比较，0.1Gy照射组CCNGl基因平均上调倍数为2.16，0.5Gy照射组CCNGl基因平均上调倍数为4.01，1.0Gy照射组CCNGl基因平均上调倍数为5.49 ;根据上调倍数和实施例一中照射后24h的拟合剂量-效应曲线方程:y=4.269X+1.457，计算得到各组动物受照射剂量分别为0.165Gy，0.598Gy和0.945Gy。
[0039]结果表明，小鼠在低剂量电离辐射后24h，外周血淋巴细胞中CCNGl基因表达上调，与照射剂量正相关，呈现一定的剂量-效应关系，根据剂量-效应曲线计算得到的理论受照剂量接近实际受照剂量。
[0040]表1不同剂量6tlCo Y射线照射后动物外周血淋巴细胞中CCNGl基因表达变化
照射剂量理论值(Gy) CCNGl基因表达变化倍数 ' 照射剂量实际值(Gy)
[0041]
【权利要求】
1.细胞周期蛋白Gl作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用。
2.权利要求1中细胞周期蛋白Gl作为一种快速检测辐射剂量的生物指标，其特征在于，一定时间范围内细胞周期蛋白Gl基因mRNA表达量与辐射剂量相关。
3.权利要求2中所述辐照剂量特征为低剂量电离辐射。
4.细胞周期蛋白Gl作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用，包括如下步骤: (1)按照常规方法培养离体细胞或饲养哺乳动物，将细胞或动物置于已知辐射强度的环境中接受福射，照后在24h、48h收集福射后细胞或米集哺乳动物外周血淋巴细胞，定量检测其细胞周期蛋白Gl的mRNA表达水平，获得该细胞或哺乳动物受到的电离辐射剂量和细胞周期蛋白Gl表达水平关系的标准曲线； (2)收集接受了待测剂量的辐射照射的离体细胞，或将哺乳动物置于待测剂量的环境中接受辐射，照后分离外周血淋巴细胞，测定其细胞周期蛋白Gl的mRNA表达水平，根据步骤(I)获得的标准曲线计算得到该细胞或动物所受的辐射剂量。
5.权利要求4中所述细胞周期蛋白Gl也可以联合其他指标，共同估算辐射剂量。
6.权利要求4中所述离体细胞可以来源于细胞株，如人淋巴母细胞，也可来自离体细胞，如人或哺 乳动物的外周血淋巴细胞。
【文档编号】C12Q1/68GK103642904SQ201310585411
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】何颖, 沈先荣, 钱甜甜, 王庆蓉, 陈伟, 刘玉明, 蒋定文, 侯登勇, 李珂娴, 刘琼 申请人:中国人民解放军海军医学研究所