毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法
【专利摘要】本发明公开了一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，本方法是以脂肪酶基因、重组载体和酵母宿主为出发材料，利用酵母重组表达和高密度发酵，基于高效胞内表达脂肪酶制备重组毕赤酵母全细胞，同时结合通透性处理，将通透型酵母全细胞应用于生物柴油催化，制备高得率的生物柴油。本发明的重组毕赤酵母全细胞催化剂，制备过程简易，无污染，是一种绿色制备生物柴油的优良生物催化剂；重组毕赤酵母全细胞催化剂，能适应广谱油源，具有良好的短炼醇耐受性，相对其他全细胞催化剂，更容易通过高密度发酵而大规模制备，因此成本低廉，具有较好的经济效益和社会效益。
【专利说明】毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程与能源【技术领域】，涉及一种生物柴油的制备方法，尤其是一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法。
【背景技术】
[0002]生物柴油是由动植物油脂与短链醇甲醇或乙醇，在催化剂的作用下发生转酯化反应生成的长链脂肪酸甲酯或者乙酯，是一类环保、可再生的，可替代石化柴油的清洁能源。制备生物柴油的催化剂可分为酸碱催化剂和脂肪酶催化剂。酸碱催化存在环境污染、腐蚀生产设备等缺陷。对于酸价较高的废弃油脂(如地沟油)，碱催化还会形成皂化反应，妨碍反应的进一步进行。脂肪酶催化可克服上述酸碱催化的缺陷而受到学术界和工业界的重视。目前脂肪酶催化生物柴油应用得较多的是固定化脂肪酶和全细胞形式的脂肪酶催化剂。与固定化脂肪酶相比较，全细胞催化剂避免了酶的分离纯化和固定化操作，进一步降低了催化剂制备成本。
[0003]目前，已有酶催化技术，有以下几类全细胞形式的脂肪酶催化剂应用于生物柴油催化:野生型丝状真菌、重组型丝状真菌、重组大肠杆菌、重组酿酒酵母、基于表面展示的重组型酿酒酵母和毕赤酵母。野生型和重组型丝状真菌全细胞脂肪酶在发酵培养时，需要加入生物兼容性树脂等固定化材料，制备固定化全细胞，无疑增加了全细胞催化剂的成本。如中国专利(CN1944629 )公开了酵母菌体与固定化材料硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙的固定化全细胞制备方法；中国专利(200610089767.1)公开了游离型和戊二醛聚氨酯交联的固定化丝状真菌米根霉OryzaeWOAmi细胞催化脂肪酸及含酸油脂生产生物柴油的方法。重组大肠杆菌，重组酿酒酵母全细胞脂肪酶由于细胞高密度发酵能力不及毕赤酵母，在规模化制备全细胞催化剂上存在不足。酿酒酵母还存在过糖基化现象，影响功能性脂肪酶的表达量。而基于表面展示的重组酵母全细胞脂肪酶由于锚定蛋白和目标脂肪酶是以融合蛋白的形式表达，会造成活性脂肪酶表达量不高，而且寻求锚定蛋白、宿主与目标脂肪酶之间的兼容性耗时费力。`
[0004]相比较而言，毕赤酵母高密度发酵能力优于丝状真菌、大肠杆菌、酿酒酵母。与酿酒酵母比较，不存在过糖基化现象。而且与胞外分泌表达一样，毕赤酵母胞内表达可以获得比表面展示表达更高的活性表达量，且遗传操作不及表面展示复杂，具有工业应用的全细胞催化剂应满足可高密度发酵规模化制备，全细胞中含有足够量的活性脂肪酶，同时无需固定化步骤，对于重组全细胞还要求遗传操作简单，成本低廉。经检索，胞内重组表达的重组型毕赤酵母全细胞催化剂及其生物柴油催化应用尚未见报导。
[0005]因此，目前需要研究开发一种能够高密度发酵、脂肪酶活性表达量高、遗传操作简易的重组全细胞脂肪酶制备及其催化生物柴油技术。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法。
[0007]本发明的技术方案是:
一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，以脂肪酶基因、重组载体和酵母宿主为出发材料，利用酵母重组表达和高密度发酵，基于高效胞内表达脂肪酶制备重组毕赤酵母全细胞，同时结合通透性处理，将通透型酵母全细胞应用于生物柴油催化，制备高得率的生物柴油，其工艺步骤为:
(1)重组及转化:通过构建目的脂肪酶基因的重组质粒，重组质粒的转化，及含有高拷贝目的基因转化子的筛选，得到高效的胞内表达重组酵母工程菌；
(2)诱导:通过重组酵母工程菌菌体积累阶段和脂肪酶诱导表达阶段培养方式，高密度生产重组酵母细胞及高效表达胞内脂肪酶，得到湿全细胞；
(3)通透处理:采用短链醇和/或冷冻干燥对湿全细胞进行通透性处理，得到通透性全细胞；
(4)催化合成:以油脂和短链醇为底物，以通透性酵母全细胞为催化剂，在无溶剂体系或溶剂体系中反应合成生物柴油。
[0008]以上步骤(1)中所述的重组质粒为pPICZA与目标脂肪酶基因连接构建重组质粒，然后转化毕赤酵母感受态细胞，得到高拷贝目标基因的转化子；所述的高拷贝基因的转化子为在浓度为500-2000 μ g/ml博莱霉素(Zeocin)抗性YPD平板上能正常生长的转化子；所述毕赤酵母为 ZYcAia pas tor is X3 3 或 ZYcAia pas tor is GSl 15 或 ZYcAia pas tor isKM71。
[0009]以上步骤(2)中所述的菌体积累阶段为重组酵母工程菌在以甘油为碳源的培养基质中，如BMGY培养基中，待菌体密度达到0D600_=2-6时，进入脂肪酶表达阶段；所述的脂肪酶诱导表达阶段是指以甲醇为唯一碳源的培养基，如BMMY培养基，每隔24h添加1% (v/v)甲醇至培养液中，保持脂肪酶的诱导表达和菌体的进一步生长。
[0010]所述的高密度生产是指由菌体积累阶段过渡到脂肪酶诱导表达阶段，需要更换新鲜培养基；需将菌体积累阶段获得的菌体室温无菌离心收获，然后将这些菌体无菌转接到脂肪酶诱导表达的新鲜培养基中，并开始每隔24h添加甲醇开始诱导并进一步大量积累菌体。
[0011]所述的高效表达是指受甲醇诱导的强启动子在持续的甲醇诱导条件下驱动脂肪酶大量表达；所述的胞内为没有信号肽指引的蛋白质转运，表达生产的脂肪酶保留在胞内，而没有分泌到胞外的培养液中。
[0012]以上步骤(2)中所述的诱导的培养条件为:摇瓶装液量10-30%，摇床转速250-300rpm，培养温度为28-30° C，菌体积累阶段培养时间12_18h，诱导表达阶段培养时间 24-168h。
[0013]所述的湿全细胞的获取条件为将诱导后的培养物4° C，4000g离心5 min，再用
0.85%NaCl溶液重悬再离心两次，得到湿全细胞。
[0014]以上步骤(3)所述的通透处理为将湿全细胞在短链醇溶液中处理10_360min，然后离心收集全细胞；所述的短链醇为10-40% (v/v)的甲醇、乙醇、异丙醇；所述的冷冻干燥为湿全细胞在-80° C下冷冻12-24h，然后在-50° C下冷冻干燥24_72h ;所述的通透性全细胞为采用上述短链醇和/或冷冻干燥处理过的全细胞。[0015]以上步骤(4)所述的底物为油脂和短链醇混合物，油脂和短链醇的摩尔比为1:1-1:6 ;所述的油酯为动植物(如大豆油、菜籽油、玉米油、棉籽油)、微生物来源的油脂(如微藻油)，也包含高酸价的废弃油脂(如地沟油)；所述的短链醇为甲醇或乙醇；所述的无溶剂体系为不添加任何反应介质；所述的溶剂体系为叔丁醇或正己烷或石油醚溶剂；所述酵母全细胞为重组毕赤酵母胞内表达脂肪酶；所述的油酯与短链醇的反应为酯化和/或转酯化反应。
[0016]以上所述的脂肪酶为对油酯和甲醇具有催化作用的一类脂肪酶，如疏绵状嗜热丝抱菌 Thermomyces Ianuginosus 脂肪酶 Tll,南极假丝酵母 Candida antarctica 脂肪酶，米根霉脂肪酶,解脂耶氏酵母ia脂肪酶,米赫毛霉Mucor miehe 脂肪酶。
[0017]以上步骤(4)所述的催化合成控制温度为30-50° C，时间为12_240h ;进行振荡的转速为200rpm ;合成反应结束后,将反应液与去离子水混均,8000 X g离心IOmin,上层即为生物柴油的脂肪酸酯成分，生物柴油得率为50-98%。
[0018]本发明相对于现有的技术具有优点和积极效果:
1、本发明的重组毕赤酵母全细胞催化剂，制备过程简易，无污染，是一种绿色制备生物柴油的优良生物催化剂。
[0019]2、本发明的重组毕赤酵母全细胞催化剂，能适应广谱油源，具有良好的短炼醇耐受性。
[0020]3、本发明的重组毕赤酵母全细胞催化剂，相对其他全细胞催化剂，更容易通过高密度发酵而大规模制备，因此成本低廉，具有较好的经济效益和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
·[0021]图1是本发明的工艺流程示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0023]实施例1
本实施例的毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法是:
(I)重组及转化:
通过构建目的脂肪酶基因的重组质粒，重组质粒的转化，及含有高拷贝目的基因转化子的筛选，得到高效的胞内表达重组酵母工程菌；
所述的重组质粒为PPICZA与目标脂肪酶基因连接构建重组质粒，然后转化毕赤酵母感受态细胞，得到高拷贝目标基因的转化子；所述的高拷贝基因的转化子为在浓度为1000 μ g/mlt博莱霉素(Zeocin)抗性YPD平板上能正常生长的转化子；所述毕赤酵母为Pichia pas toris GSl15。
[0024](2)诱导:
通过重组酵母工程菌菌体积累阶段和脂肪酶诱导表达阶段培养方式，高密度生产重组酵母细胞及高效表达胞内脂肪酶，得到湿全细胞；
所述的菌体积累阶段为重组酵母工程菌在BMGY培养基中培养，待菌体密度达到(?_=6时，进入脂肪酶表达阶段；所述的脂肪酶诱导表达阶段是指以甲醇为唯一碳源的BMMY培养基，每隔24h添加1% (v/v)甲醇至培养液中，保持脂肪酶的诱导表达和菌体的进一步生长。
[0025]所述的高密度生产是指由菌体积累阶段过渡到脂肪酶诱导表达阶段，需要更换新鲜培养基；需将菌体积累阶段获得的菌体室温无菌离心收获，然后将这些菌体无菌转接到脂肪酶诱导表达的新鲜培养基中，并开始每隔24h添加甲醇开始诱导并进一步大量积累菌体。
[0026]所述的高效表达是指受甲醇诱导的强启动子在持续的甲醇诱导条件下驱动脂肪酶大量表达；所述的胞内为没有信号肽指引的蛋白质转运，表达生产的脂肪酶保留在胞内，而没有分泌到胞外的培养液中。
[0027]所述的诱导的培养条件为:摇瓶装液量20%，摇床转速280rpm，培养温度为28-30° C，菌体积累阶段培养时间16h，诱导表达阶段培养时间48h。
[0028]所述的湿全细胞的获取条件为将诱导后的培养物4° C，4000 Xg离心5 min，再用0.85%NaCl溶液重悬再离心两次，得到湿全细胞。
[0029](3)通透处理:
采用短链醇和/或冷冻干燥对湿全细胞进行通透性处理，得到通透性全细胞； 所述的通透处理为将湿全细胞在短链醇溶液中处理200min，然后离心收集全细胞；所述的短链醇为40% (v/v)的异丙醇；所述的冷冻干燥为湿全细胞在-80° C下冷冻IShi然后在-50° C下冷冻干燥50h ;所述的通透性全细胞为采用上述短链醇和/或冷冻干燥处理过的全细胞。
[0030](4)催化合成:
以油脂和短链醇为底物，以通透性酵母全细胞为催化剂，在无溶剂体系中反应合成生物柴油；
所述的底物为油脂和短链醇混合物，油脂和短链醇的摩尔比为1:3 ;所述的油酯为地沟油；所述的短链醇为甲醇；所述的无溶剂体系为不添加任何反应介质；所述酵母全细胞为重组毕赤酵母胞内表达脂肪酶，细胞用量为10% (占油重);所述的油酯与短链醇的反应为酯化和转酯化反应。
[0031]以上所述的脂肪酶为对油酯和甲醇具有催化作用的一类脂肪酶，如南极假丝酵母Candida antarctica 脂肪酶。
[0032]所述的催化合成控制温度为40° C，时间为120h ;进行振荡的转速为200rpm ;合成反应结束后，将反应液与去离子水混均，SOOOXg离心lOmin，上层即为生物柴油的脂肪酸酯成分，生物柴油得率为88%。
[0033]实施例2
本实施例的毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法是:
(I)重组及转化:
通过构建目的脂肪酶基因的重组质粒，重组质粒的转化，及含有高拷贝目的基因转化子的筛选，得到高效的胞内表达重组酵母工程菌；
所述的重组质粒为PPICZA与目标脂肪酶基因连接构建重组质粒，然后转化毕赤酵母感受态细胞，得到高拷贝目标基因的转化子；所述的高拷贝基因的转化子为在浓度为2000μ g/ml。博莱霉素(Zeocin)抗性YPD平板上能正常生长的转化子；所述毕赤酵母为/7ZcAiapastor is X33。
[0034](2)诱导:
通过重组酵母工程菌菌体积累阶段和脂肪酶诱导表达阶段培养方式，高密度生产重组酵母细胞及高效表达胞内脂肪酶，得到湿全细胞；
所述的菌体积累阶段为重组酵母工程菌在以甘油为碳源的BMGY培养基中培养，待菌体密度达到0D_=4时，进入脂肪酶表达阶段；所述的脂肪酶诱导表达阶段是指以甲醇为唯一碳源的BMMY培养基，每隔24h添加1% (v/v)甲醇至培养液中，保持脂肪酶的诱导表达和菌体的进一步生长。
[0035]所述的高密度生产是指由菌体积累阶段过渡到脂肪酶诱导表达阶段，需要更换新鲜培养基；需将菌体积累阶段获得的菌体室温无菌离心收获，然后将这些菌体无菌转接到脂肪酶诱导表达的新鲜培养基中，并开始每隔24h添加甲醇开始诱导并进一步大量积累菌体。
[0036]所述的高效表达是指受甲醇诱导的强启动子在持续的甲醇诱导条件下驱动脂肪酶大量表达；所述的胞内为没有信号肽指引的蛋白质转运，表达生产的脂肪酶保留在胞内，而没有分泌到胞外的培养液中。
[0037]所述的诱导的培养条件为:摇瓶装液量30%，摇床转速300rpm，培养温度为28-30° C，菌体积累阶段培养时间12h，诱导表达阶段培养时间96h。
[0038]所述的湿全细胞的获取条件为将诱导后的培养物4° C，4000 Xg离心5 min，再用0.85%NaCl溶液重悬再离心两次，得到湿全细胞。
[0039](3)通透处理:
采用短链醇和/或冷冻干燥对湿全细胞进行通透性处理，得到通透性全细胞；
所述的通透处理为将湿全细胞在短链醇溶液中处理360min，然后离心收集全细胞；所述的短链醇为20% (v/v)的甲醇；所述的冷冻干燥为湿全细胞在-80° C下冷冻24h，然后在-50° C下冷冻干燥24 ;所述的通透性全细胞为采用上述短链醇和/或冷冻干燥处理过的全细胞。
[0040](4)催化合成:
以油脂和短链醇为底物，以通透性酵母全细胞为催化剂，在无溶剂体系中反应合成生物柴油；
所述的底物为油脂和短链醇混合物，油脂和短链醇的摩尔比为1: 4;所述的油酯为菜籽油；所述的短链醇为甲醇；所述的无溶剂体系为不添加任何反应介质；所述酵母全细胞为重组毕赤酵母胞内表达脂肪酶，细胞用量为10% (占油重);所述的油酯与短链醇的反应为转酯化反应。
[0041]以上所述的脂肪酶为对油酯和甲醇具有催化作用的一类脂肪酶，如疏绵状嗜热丝抱菌 Thermomyces Ianuginosus 月旨肪酶 Tl I。
[0042]所述的催化合成控制温度为50° C，时间为160h ;进行振荡的转速为200rpm ;合成反应结束后，将反应液与去离子水混均，SOOOXg离心lOmin，上层即为生物柴油的脂肪酸酯成分，生物柴油得率为82%。
[0043]实施例3
本实施例的毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法是:(I)重组及转化:
通过构建目的脂肪酶基因的重组质粒，重组质粒的转化，及含有高拷贝目的基因转化子的筛选，得到高效的胞内表达重组酵母工程菌；
所述的重组质粒为PPICZA与目标脂肪酶基因连接构建重组质粒，然后转化毕赤酵母感受态细胞，得到高拷贝目标基因的转化子；所述的高拷贝基因的转化子为在浓度为
500μ g/ml ο博莱霉素(Zeocin)抗性YPD平板上能正常生长的转化子；所述毕赤酵母为Pichia pas toris KM71。
[0044](2)诱导:
通过重组酵母工程菌菌体积累阶段和脂肪酶诱导表达阶段培养方式，高密度生产重组酵母细胞及高效表达胞内脂肪酶，得到湿全细胞；
所述的菌体积累阶段为重组酵母工程菌在以甘油为碳源的BMGY培养基中培养，待菌体密度达到0D_=2时，进入脂肪酶表达阶段；所述的脂肪酶诱导表达阶段是指以甲醇为唯一碳源的培养基为BMMY培养基，每隔24h添加1% (v/v)甲醇至培养液中，保持脂肪酶的诱导表达和菌体的进一步生长。
[0045]所述的高密度生产是指由菌体积累阶段过渡到脂肪酶诱导表达阶段，需要更换新鲜培养基；需将菌体积累阶段获得的菌体室温无菌离心收获，然后将这些菌体无菌转接到脂肪酶诱导表达的新鲜培养基中，并开始每隔24h添加甲醇开始诱导并进一步大量积累菌体。
[0046]所述的高效表达是指受甲醇诱导的强启动子在持续的甲醇诱导条件下驱动脂肪酶大量表达；所述的胞内为没有信号肽指引的蛋白质转运，表达生产的脂肪酶保留在胞内，而没有分泌到胞外的培养液中。
[0047]所述的诱导的培养条件为:摇瓶装液量10%，摇床转速250rpm，培养温度为28-30° C，菌体积累阶段培养时间18h，诱导表达阶段培养时间168h。
[0048]所述的湿全细胞的获取条件为将诱导后的培养物4° (:，4000\8离心51^11，再用
0.85%NaCl溶液重悬再离心两次，得到湿全细胞。
[0049](3)通透处理:
采用短链醇和/或冷冻干燥对湿全细胞进行通透性处理，得到通透性全细胞；
所述的通透处理为将湿全细胞在短链醇溶液中处理lOOmin，然后离心收集全细胞；所述的短链醇为10% (v/v)的异丙醇；所述的冷冻干燥为湿全细胞在-80° C下冷冻12h，然后在-50° C下冷冻干燥72h ;所述的通透性全细胞为采用上述短链醇和/或冷冻干燥处理过的全细胞。
[0050](4)催化合成:
以油脂和短链醇为底物，以通透性酵母全细胞为催化剂，在无溶剂体系中反应合成生物柴油；
所述的底物为油脂和短链醇混合物，油脂和短链醇的摩尔比为1: 6;所述的油酯为大豆油；所述的短链醇为甲醇；所述的无溶剂体系为不添加任何反应介质；所述酵母全细胞为重组毕赤酵母胞内表达脂肪酶，细胞用量为10% (占油重);所述的油酯与短链醇的反应为转酯化反应。
[0051]以上所述的脂肪酶为对油酯和甲醇具有催化作用的一类脂肪酶，如米赫毛霉Mucor miehe 脂肪酶。
[0052]所述的催化合成控制温度为30° C，时间为240h;进行振荡的转速为200rpm;合成反应结束后，将反应液与去离子水混均，SOOOXg离心lOmin，上层即为生物柴油的脂肪酸酯成分，生物柴油得率为92%。`
【权利要求】
1.一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于:以脂肪酶基因、重组载体和酵母宿主为出发材料，利用酵母重组表达和高密度发酵，基于高效胞内表达脂肪酶制备重组毕赤酵母全细胞，同时结合通透性处理，将通透型酵母全细胞应用于生物柴油催化，制备高得率的生物柴油，其工艺步骤为: (1)重组及转化:通过构建目的脂肪酶基因的重组质粒，重组质粒的转化，及含有高拷贝目的基因转化子的筛选，得到高效的胞内表达重组酵母工程菌； (2)诱导:通过重组酵母工程菌菌体积累阶段和脂肪酶诱导表达阶段培养方式，高密度生产重组酵母细胞及高效表达胞内脂肪酶，得到湿全细胞； (3)通透处理:采用短链醇和/或冷冻干燥对湿全细胞进行通透性处理，得到通透性全细胞； (4)催化合成:以油脂和短链醇为底物，以通透性酵母全细胞为催化剂，在无溶剂体系或溶剂体系中反应合成生物柴油。
2.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于:以上步骤(1)中所述的重组质粒为PPICZA与目标脂肪酶基因连接构建重组质粒，然后转化毕赤酵母感受态细胞，得到高拷贝目标基因的转化子；所述的高拷贝基因的转化子为在浓度为500-2000 μ g/ml博莱霉素(Zeocin)抗性YPD平板上能正常生长的转化子；所述毕赤酵母为 ZYcAia pas tor is X3 3 或 ZYcAia pas tor is GSl 15 或 ZYcAia pas tor isKM71。
3.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于:以上步骤(2)中所述的菌体积累阶段为重组酵母工程菌在以甘油为碳源的BMGY培养基中，待菌体密度达到0D_=2-6时，进入脂肪酶表达阶段；所述的脂肪酶诱导表达阶段是指以甲醇为唯一碳源的BMMY培养基，每隔24h添加1% (v/v)甲醇至培养液中，保持脂肪酶的诱导表达和菌体的进一步生长`； 所述的高密度生产是指由菌体积累阶段过渡到脂肪酶诱导表达阶段，需要更换新鲜培养基；需将菌体积累阶段获得的菌体室温无菌离心收获，然后将这些菌体无菌转接到脂肪酶诱导表达的新鲜培养基中，并开始每隔24h添加甲醇开始诱导并进一步大量积累菌体； 所述的高效表达是指受甲醇诱导的强启动子在持续的甲醇诱导条件下驱动脂肪酶大量表达；所述的胞内为没有信号肽指引的蛋白质转运，表达生产的脂肪酶保留在胞内，而没有分泌到胞外的培养液中。
4.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于:以上步骤(2)中所述的诱导的培养条件为:摇瓶装液量10-30%，摇床转速250-300rpm，培养温度为28-30° C，菌体积累阶段培养时间12_18h，诱导表达阶段培养时间 24-168h ； 所述的湿全细胞的获取条件为将诱导后的培养物4° C，4000g离心5min，再用0.85%NaCl溶液重悬再离心两次，得到湿全细胞。
5.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于:以上步骤(3)所述的通透处理为将湿全细胞在短链醇溶液中处理10-360min，然后离心收集全细胞；所述的短链醇为10-40% (v/v)的甲醇、乙醇、异丙醇；所述的冷冻干燥为湿全细胞在-80° C下冷冻12-24h，然后在-50° C下冷冻干燥24_72h ;所述的通透性全细胞为采用上述短链醇和/或冷冻干燥处理过的全细胞。
6.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于:以上步骤(4)所述的底物为油脂和短链醇混合物，油脂和短链醇的摩尔比为1:1-1: 6;所述的油酯为动植物、微生物来源的油脂:大豆油、菜籽油、玉米油、棉籽油、微藻油，也包含高酸价的废弃油脂:地沟油；所述的短链醇为甲醇、乙醇；所述的无溶剂体系为不添加任何反应介质；所述的溶剂体系为叔丁醇或正己烷或石油醚溶剂；所述酵母全细胞为重组毕赤酵母胞内表达脂肪酶；所述的油酯与短链醇的反应为酯化和/或转酯化反应； 所述的脂肪酶为对油酯和甲醇具有催化作用的一类脂肪酶:疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces Ianuginosus脂肪酶T11,南极假丝酵母Candida an tare tica脂肪酶,米根霉Rhizopus脂肪酶,解脂耶氏酵母ia脂肪酶,米赫毛霉ifocor miehe脂肪酶。
7.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于:以上步骤(4)所述的催化合成控制温度为30-50° C，时间为12-240h ;进行振荡的转速为200rpm ;合成反应结束后,将反应液与去离子水混均,8000Xg离心IOmin,上层即为生物柴油的脂肪酸酯成分，生物柴油得率为50-98%。
【文档编号】C12R1/84GK103789364SQ201310585029
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】阎金勇, 蒋永强, 钟志健, 卢汉狼, 吕军, 潘勤春, 甘敏鑫 申请人:南宁市新科健生物技术有限责任公司