一种利用脂肪酶催化合成二氢杨梅素单酯化物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物催化领域，涉及一种利用脂肪酶催化合成二氢杨梅素单酯化物的 方法。
【背景技术】
[0002] 二氢杨梅素是一种黄酮苷兀化合物，化学名为3, 5, 7, 3'，4'，5' -六羟基-2, 3-双 氢黄酮醇（dihydromyricetin，DMY)，又名双氢杨梅树皮素、双氢杨梅素、蛇葡萄素。二氢杨 梅素在干燥显齿蛇葡萄茎叶中的质量分数可高达30%以上。二氢杨梅素具有多种药理活 性，如消炎、镇痛、止咳、祛痰、抗高血压、保肝护肝及解酒、消脂、降糖、增强免疫力、抗氧化 和抑菌作用等，有望开发成食品抗氧化剂、保健食品、化妆品、医药品等。
[0003] 二氢杨梅素分子油溶性较差，限制了其在油相中的分散性，不利于其抗氧化作用 的发挥。将二氢杨梅素分子中某个羟基进行酯化可以提高其油溶性，增强其抗氧化活性，实 用价值更大。
[0004] 酯化修饰通常采用化学法和酶法。采用化学法位置缺乏专一性，可能使具有抗氧 化作用的羟基被酯化，虽然增加了亲油性，但降低了化合物本身的抗氧化效果。酶促酯化一 般采用脂肪酶对羟基进行酯化，由于酶对底物有良好的专一性，可以选择性地酯化某一羟 基，并且反应条件温和，副产物少，在食品行业具有重要的应用价值。目前绝大多数酶法酯 化黄酮化合物的报道是针对黄酮苷糖基上羟基的，对黄酮苷元上羟基的酯化鲜有报道。二 氢杨梅素羟基大多是直接连接于苯环，由于苯环的吸电子效应，羟基的氧原子电子云密度 降低，使羟基酯化反应变得困难。目前未见关于二氢杨梅素酶法酯化的报道。
[0005] 二氢杨梅素分子上含有多个羟基，其抗氧化活性差别较大，通过量子化学计算二 氢杨梅素3位羟基（3-0H)是抗氧化活性最弱的羟基，所以将3-0H进行酯化可以在提高二 氢杨梅素油溶性的同时最大限度地保留其抗氧化活性。
[0006] 酶固定化（Enzymeimmobilization)技术是利用物理或化学的方法使游离酶定位 于限定的空间区域，保持其活性，并被反复利用的方法。酶固定化可提高单位体积的酶密 度，对环境的耐受力增强（如PH值、温度、有机溶剂、有毒物质等）、酶易回收等优点。酶固 定化技术是20世纪60年代发展起来的一门新兴生物技术，在化工、发酵生产、能源、医药等 行业，实际应用效果显著。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种利用脂肪酶催化合成二氢杨梅素单酯化物的方法。该 方法在最大限度的保留了二氢杨梅素的抗氧化活性的同时增强其油溶性，反应条件温和、 反应专一性高、选择性高、脂肪酶可多次重复利用、生产成本低等优点。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] -种利用脂肪酶催化合成二氢杨梅素单酯化物的方法为用游离脂肪酶或固定化 脂肪酶催化二氢杨梅素与酰基供体合成二氢杨梅素单酯化物；所述的二氢杨梅素单酯化物 为二氢杨梅素的3位羟基酯化。
[0010] 所述的游离脂肪酶包括：沙门柏干酪青霉脂肪酶（LPC)、华根霉脂肪酶（Lipase RC)、洋葱假单胞菌脂肪酶（PCL)、猪胰脂肪酶（PPL)、雪白根霉脂肪酶（LipaseRN)、扩展 青霉脂肪酶（PEL)、黑曲霉HGD0823脂肪酶。所述的固定化脂肪酶包括：Lip〇ZymeIMTL、 Lipozyme?RM、Novozym435、固定化黑曲霉HGD0823 脂肪酶。
[0011] 上述脂肪酶中沙门柏干酪青霉脂肪酶（LPC)、华根霉脂肪酶（LipaseRC)、洋葱假 单胞菌脂肪酶（PCL)、猪胰脂肪酶（PPL)、雪白根霉脂肪酶（LipaseRN)、扩展青霉脂肪酶 (PEL)、Lipozyme?TL、Lipozyme?RM、Novozym435均为商业化产品，可以直接从商家购买 得到。黑曲霉HGD0823脂肪酶由黑曲霉HGD0823发酵制备得到。再采用吸附法固定黑曲 霉HGD0823脂肪酶得到固定化黑曲霉HGD0823脂肪酶，吸附法固定脂肪酶的方法具体包括 如下步骤：①将粗酶粉溶于甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中（0. 〇5M、pH9. 4)，在30~40°C下以 150~200r/min搅拌1~2h;②在4~KTC下以5000r/min离心，取上清液；③将D4020 树脂用95 %乙醇浸泡24h后，用去离子水洗至滤液澄清为止，将其添加到②上清液中；④在 35~40°C、150~200r/min下，振荡4~5h后，用砂芯漏斗过滤，用上述缓冲液冲洗3次， 抽滤后冷冻干燥得到固定化脂肪酶，在〇~4°C保存。
[0012] 优选的，所述的利用脂肪酶催化合成二氢杨梅素单酯化物的方法包括如下步骤：
[0013] (1)将二氢杨梅素与酰基供体溶于有机溶剂中，再加入游离脂肪酶或固定化脂肪 酶，于30~40°C、200~300r/min摇床反应1~2天。
[0014] (2)反应结束后，将反应液离心，取上清液，将溶剂回收，得到的固体即为含二氢杨 梅素单酯化物的产物。
[0015] 步骤（1)中所述的酰基供体包括：乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙 烯酯、苯甲酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯。
[0016] 步骤⑴中二氢杨梅素与酰基供体的摩尔比优选为1:20~30。
[0017] 步骤（1)中所述的有机溶剂包括：乙腈、丙酮、四氢呋喃、叔丁醇、二甲基亚砜。
[0018] 步骤（1)中所述的脂肪酶的量优选为250U/mL。
[0019] 本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
[0020] 本发明是首次利用脂肪酶催化合成二氢杨梅素单酯化物。相对于传统化学法合成 二氢杨梅素单酯化物，本发明反应条件温和、工艺步骤简单、环境友好、可重复利用和连续 化生产容易大规模工业化生产。
[0021] 本发明使用固定化脂肪酶，具有脂肪酶与底物和产物容易分离的特点，而且脂肪 酶的使用寿命长，可重复利用和连续化生产，大大降低了生产成本。
[0022] 本发明产物的酯化位置在抗氧化活性最低的3_羟基，最大限度的保留了二氢杨 梅素的抗氧化活性，同时增强其油溶性。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0024]
[0025] 式I为二氢杨梅素分子结构，二氢杨梅素分子6个羟基的抗氧化活性有所不同。分 子脱氢前后生成热之差（AHOF)能够较好地判断黄酮及多酚类物质的抗氧化活性，AHOF 值越小说明分子脱氢后所形成的自由基越稳定，分子的抗氧化活性越强。通过用AHOF来 比较二氢杨梅素6个羟基抗氧化活性。二氢杨梅素各羟基AHOF见下表：
[0026]
[0027] 根据表中量子化学计算的AHOF结果，二氢杨梅素6个羟基抗氧化能力依次为： 4'-OH> 5'-OH> 3'-OH> 7-0H> 5-0H> 3-0H。从二氢杨梅素分子6个羟基抗氧化能力 计算结果可以看出，3位羟基（3-0H)抗氧化活性最弱。二氢杨梅素分子的生成热（HOF)为 281.3931kJ/mol〇
[0028] 实施例1
[0029] (1)将二氢杨梅素溶于2mL有机溶剂中，全部溶解后再加入乙酸乙烯酯（二氢杨梅 素与乙酸乙烯酯的初始浓度分别为20、500mmol/L)，再加入500U的固定化黑曲霉HGD0823 脂肪酶，在温度35°C、摇床转速200r/min的条件下反应24小时。<