一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及二氢杨梅素技术领域，具体地，涉及一种载二氢杨梅素三元复合脂质 体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata)，俗名藤茶，是国家卫计委公布的新食 品原料。二氢杨梅素是一种多酚羟基双氢黄酮醇，是显齿蛇葡萄的主要活性成分。医学研 宄表明，二氢杨梅素具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗血栓、抗菌、降血糖、降血压、保肝护 肝以及减轻乙醇中毒等功效。但由于二氢杨梅素自身脂溶性差、易被氧化和降解等缺点，这 大大限制了其在医药和食品等行业的应用。如果将二氢杨梅素搭载安全高效的药物载体， 携带二氢杨梅素进入目标细胞，则能有效的克服其性质上的缺陷。
[0003] 目前，药物投递主要采用非病毒类载体，非病毒类载体具有良好的安全性和稳定 性，且制备简单、成本较低。常用的非病毒类载体主要包括脂质体、纳米颗粒、高分子聚合物 等。阳离子脂质体是运用最广泛的非病毒载体，具有较高的基因携载能力和细胞摄取率，但 表面带有大量正电荷，血液循环中容易与体环境中的聚阴离子发生反应，从而引起较大的 细胞毒性。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制 备方法，制备工艺具有操作简单、过程可控、易于保持药物生物活性等优点，为实现二氢杨 梅素在临床上的运用奠定了基础。本发明采用层层自组装技术制备载二氢杨梅素三元复 合脂质体，主要利用带相反电荷的物质在液固界面通过静电作用交替沉积而形成多层超薄 膜，并提出"阴离子脂质--阳离子脂质--羧甲基壳聚糖"这一全新多层自组装体系。羧甲 基壳聚糖是壳聚糖分子引入羧甲基后得到的水溶性衍生物，可生物降解，是一种PH敏感性 材料。当pH>7. 0时，由于羧基的离子化而带负电；当pH〈7. 0时，由于氨基的质子化而带正 电。在血液循环PH7. 4条件下，羧甲基壳聚糖带负电，紧密吸附于阳离子脂质的表面，可以 保护载体免受血清中蛋白的相互作用，提高了载体在血液循环中的稳定性。当到达肿瘤组 织后，由于肿瘤组织通常为酸性，羧甲基壳聚糖在这种酸性条件下带正电，与带正电的阳 离子脂质发生排斥，便从载体表面脱离，暴露出带正电的阳离子脂质。
[0005] 本发明的技术方案如下：一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，包括以 下步骤：
[0006] (1)制备阴离子脂质体：将二氢杨梅素、阴离子脂质与辅助脂质按摩尔比 2-3:3-4:3-4的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜；加入HEPES缓冲液 (pH7. 4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液；将阴离子脂 质体混悬液进行水浴超声，水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
[0007] (2)制备阴-阳离子二元复合脂质体混悬液：将阳离子脂质、辅助脂质按摩尔比的 比例1-1. 2 :0. 8-1溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜，加入一定体积的HEPES 缓冲液（PH7. 4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液；将阳 离子脂质体混悬液与步骤（1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔 比2-2. 5:1-1. 5缓缓混合，水浴超声lOmin，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
[0008] (3)制备载二氢杨梅素三元复合脂质体：随后向步骤（2)所得的阴-阳离子二元 复合脂质体混悬液中加入〇. 5% -1 %浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载 二氢杨梅素三元复合脂质体。
[0009] 较佳地，步骤（1)中阴离子脂质为磷脂酰甘油（PG)、磷脂酰肌醇（PI)、磷脂酰丝氨 酸（PS)中的一种或数种的混合物。
[0010] 较佳地，步骤（1)、（2)中的辅助脂质为二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)、磷脂酰胆 碱（PC)、胆固醇（CHOL)中的一种或数种的混合物。
[0011] 较佳地，步骤⑶中阳离子脂质为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵 (DOTAP)，1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯（DOSC)，氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基 丙基铵（DOTM)中的一种或数种的混合物。
[0012] 本发明的有益效果为：用本发明所述的载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方 法，制备的"阴离子脂质一阳离子脂质一羧甲基壳聚糖"这一全新的三元复合脂质体，既保 留了阳离子脂质较高的药物携载能力和细胞摄取率等优点，同时由于阴离子脂质的加入， 中和了部分阳离子表面的电荷，有效的降低了脂质体的毒性。而将具有长循环功能的羧甲 基壳聚糖引入到载体的组装中，则巧妙的利用了羧甲基壳聚糖对PH值的敏感性，实现二氢 杨梅素在不同介质中的选择性释放。与一般载体相比，使二氢杨梅素在到达靶向位置之前 得到充分保护，免受血清中蛋白等的相互作用，而当载体到达指定位置后，又能及时从表面 脱落，暴露出阳离子载体，从而提高转染的效率。采用层层自主装法制备的复合脂质体，具 有操作简单，制备过程易控制等优点，同时减少了有机溶剂的使用，且静电力为弱的相互作 用力，不影响物质结构，有利于保持二氢杨梅素的生物活性。
[0013] 本发明采用基于静电吸引力的层层自组装技术，以二氢杨梅素为内核，然后依次 组装阴离子脂质层、阳离子脂质层和羧甲基壳聚糖层，构建高效低毒的三元复合脂质体，为 开发功能性二氢杨梅素类临床治疗药物奠定技术基础。组装完成的三元复合脂质体粒径为 204. 8±6. 2nm，电位为-8. 1 ±2. 5mV，具有明显的层状结构，在血浆中具有良好的稳定性，细 胞毒性小于阳离子脂质体，同时具有PH敏感性，可在不同介质中选择性释放二氢杨梅素。
【附图说明】
[0014] 图IA为阴离子脂质体的透射电镜图。
[0015] 图IB为阴-阳二元复合脂质体的透射电镜图。
[0016] 图IC为阴-阳-羧甲基壳聚糖三元复合脂质体的透射电镜图。
[0017] 图2为脂质体与血浆作用后吸光度的变化图。
[0018] 图3为复合脂质体和阳离子脂质体在H印G2细胞中的存活率比较图。
[0019] 图4为脂质体在不同磷酸盐缓冲液中二氢杨梅素的释放率比较图。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过【具体实施方式】对本发明进一步说明，以帮助更好的理解本发明的内容， 但这些【具体实施方式】不以任何方式限制本发明的保护范围。
[0021] 实施例1 :
[0022] -种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，包括以下步骤：
[0023] (1)将二氢杨梅素、磷脂酰甘油（PG)与二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)按摩尔 比2:3:3的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜，加入HEPES缓冲液 (pH7. 4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液，将阴离子脂 质体混悬液置于超声清洗仪中进行水浴超声，充分水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
[0024] (2)将溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP)、磷脂酰胆碱（PC)按摩尔比 1:1的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜，加入HEPES缓冲液（pH7. 4)，缓 缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液，将阳离子脂质体混悬液 与步骤（1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔比2:1缓缓混合，水 浴超声lOmin，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
[0025] (3)随后向步骤⑵所得的阴-阳离子二元复合脂质体混悬液中加入0. 5% -1% 浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载二氢杨梅素三元复合脂质体。
[0026] 实施例2 :
[0027] -种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0028] (1)将二氢杨梅素、磷脂酰肌醇（PI)与胆固醇（CHOL)按摩尔比2. 5:3. 5:3. 5的比 例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜，加入HEPES缓冲液（pH7. 4)，缓缓震摇 使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液，将阴离子脂质体混悬液置于超 声清洗仪中进行水浴超声，充分水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
[0029] (2)将1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯（DOSC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)按摩尔比1:0.8的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜，加入HEPES 缓冲液（PH7. 4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液，将阳 离子脂质体混悬液与步骤（1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔 比2. 5:1缓缓混合，水浴超声lOmin，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
[0030] (3)随后向步骤⑵所得的阴-阳离子二元复合脂质体混悬液中加入0. 5% -1% 浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载二氢杨梅素三元复合脂质体。
[0031] 实施例3:
[0032] -种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0033] (1)将二氢杨梅素、磷脂酰丝氨酸（PS)与二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)按摩尔比 2.8:4:3的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜