一种二氢杨梅素对映体的手性色谱分离分析方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于手性色谱分离技术领域，更具体地，涉及一种二氢杨梅素对映体的手 性色谱分离分析方法。
【背景技术】
[0003] 二氢杨梅素（Dihydromyricetin，见式I(a))是一种黄酮类化合物，其化学名为 (2R，3R)-3, 5, 7-三羟基-2- (3, 4, 5-三羟基苯基）苯并二氢吡喃-4-酮。1940年Kotake 和Kubota等首先从楝叶玉葡萄（A.Meliaefolia)的叶中分离得到。二氢杨梅素作为一种 不可多得的天然活性物质，具有抗炎抗过敏、抗氧化[现代食品科技，2014,（10) :36-41; 食品科学，2014,（20) :69-71]、止咳祛痰[中国民族医药杂志，1998,（3) :42-44]、镇痛[福 建医学杂学，1995,（4) :39-40]、抑菌[食品科技，2008,（4) :140-143]、降血脂[茶叶科学， 2007,（3) :221-225]、抗脂质过氧化[中国中药杂志，2003,1188-1191]、抗肿瘤[中华中医 药学刊，2010,（9) :1914-1915]、保肝护肝[食品科学，2008,（11) :622-625]等生理活性，具 有很高的开发利用价值和应用前景。
[0004]式I 二氢杨梅素大量存在于蛇葡萄属植物，如显齿蛇葡萄、粵蛇葡萄、羽叶蛇葡萄、东北 蛇葡萄、光叶蛇葡萄等植物中，特别是在显齿蛇葡萄植物的幼嫩茎叶中其含量可达30%以 上。目前，主要通过热水提取后重结晶纯化[现代食品科技，2009，（10) :1124-1128;食品 科技，2011，（6) :230-233 ;现代食品科技，2009,（8) :907-910]、乙醇浸泡辅助法[广东化 工，2006,（10) :5-9]、微波萃取[广州化工，2005,（2) :12-15 ;天然产物研究与开发，2005，
[5] :636-638]、低温-超声提取[中国发明专利申请201310391546.X]、微波逆流提取及膜 提取[中国发明专利申请201210229991. 1]、以水为萃取剂的逆流提取[食品科技，2004， (11) :192-194]、超临界流体萃取法[沈露，天津科技大学硕士论文，2006]等方法从蛇葡萄 属植物中提取和纯化二氢杨梅素。
[0005] 天然的二氢杨梅素具有确定的绝对构型，文献中常采用反相液相色谱法（即cls柱 或0DS柱，以乙腈/水或甲醇-水-磷酸为流动相）对二氢杨梅素产品进行纯度和含量检 测，不对绝对构型做进一步确认[Process Biochemistry，2006,41(3): 567-570 ;Journal of Chromatography A，2002,973(1) :217-220 ;湖南农业大学学报，2002，（1):32-34 ;中成 药，2004,（3):210-212 ;广东农业科学，2013,（19) :90-93]。然而，有文献报道在沸水提 取、重结晶纯化时，天然二氢杨梅素发生消旋化，（2R，3R)-二氢杨梅素和（2S，3S)-二氢 杨梅素(式I(b))同时析出，形成外消旋产物[Acta Crystallographic，2007，E63(ll): 04384和中国发明专利申请201510062355.8]。在中国发明专利申请201510062355.8,发明 人首次开发以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂、在甲醇-磷酸的流动相中添加手性添加剂 即β-环糊精的RP-HPLC拆分法对二氢杨梅素进行光学纯度检测，结果表明多种市售产品 的光学纯度（e. e%)为0。
[0006] 由于二氢杨梅素分子中含有多个羟基和芳香环，易与手性选择剂和硅胶产生较强 的氢键和Ji-Ji等相互作用，难被流动相洗脱和拆分，迄今未见直接采用手性色谱柱对二 氢杨梅素进行手性分析分离的研究报道。另一方面，手性化合物的立体构型可能对其生理 活性、毒性和临床疗效等产生极大影响。因此，在手性色谱柱上，开发一种二氢杨梅素对映 体的手性分离方法显得尤为重要。
【发明内容】
[0007] 根据目前二氢杨梅素对映体手性拆分技术中的不足，本发明提供了一种二氢杨梅 素对映体的手性色谱分离分析方法。
[0008] 本发明的技术目的通过以下技术方案实现： 本发明提供一种二氢杨梅素对映体的手性色谱分离分析方法，包括如下步骤：二氢杨 梅素样品溶解在流动相中，采用多糖衍生物手性固定相进行液相色谱分析分离； 所述流动相为正己烷和低级醇的混合溶液； 所述多糖衍生物手性固定相为涂覆三（3, 5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉、三 ((S)- (α)_苯乙基氨基甲酰化）直链淀粉、三（3, 5-二甲基苯氨基甲酰化）纤维素或三 (4-甲基苯基氨基甲酰化）纤维素手性固定相中的一种。
[0009] 发明人发现，以正己烷和低级醇作为流动相，在上述多糖衍生物手性固定相上，能 够很好地实现二氢杨梅素对映体的手性色谱分离。
[0010] 更优选地，所述多糖衍生物手性固定相为涂覆三（3, 5-二甲基苯氨基甲酰化)直链 淀粉手性固定相。
[0011] 优选地，所述流动相中正己烷和低级醇的体积比为60~80 :40~20。
[0012] 优选地，所述流动相中正己烷和低级醇的体积比为80 :20。
[0013] 优选地，所述低级醇为乙醇或异丙醇。
[0014] 更优选地，所述低级醇为乙醇。 优选地，所述流动相中还含有不大于0.5% (体积百分数）的三氟乙酸。发明人发现，在 流动相中加入少量的三氟乙酸，可以加快二氢杨梅素的洗脱速度，提高选择因子和分离度。
[0015] 更优选地，所述流动相中含有0. 1% (体积百分数）的三氟乙酸。
[0016] 优选地，所述二氢杨梅素样品的浓度不大于1. 0mgmL、
[0017] 更优选地，所述二氢杨梅素样品的浓度为0. 5mg·mL、
[0018] 优选地，所述的温度为不大于30 °C。
[0019] 优选地，所述色谱条件中流动相的流速为1. 0mL·π?η\进样体积为10μL，检测 波长为290nm，色谱柱温度为25°C〇
[0020] 更优选地，一种二氢杨梅素对映体的手性色谱分离分析方法，包括如下步骤：将二 氢杨梅素样品溶解在流动相中，采用涂覆三（3，5-二甲基苯氨基甲酰化)直链淀粉手性固定 相进行手性分离；所述流动相由正己烷、乙醇和三氟乙酸组成，其中，正己烷与乙醇的体积 比为80 :20,并添加总体积0. 1%的三氟乙酸。在上述色谱条件下，二氢杨梅素对映体的分 离度为1. 95,达到基线分离。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 在本发明公开的涂覆型手性固定相材料上，结合所述的流动相，二氢杨梅素对映体实 现了良好的手性分离，色谱峰峰型、峰展宽和拖尾等得到改善。在优选的条件下，二氢杨梅 素对映体间的分尚度达到1. 95,选择因子为1. 36。与文献方法相比，本发明开发的手性分 离法需要在正相流动相条件下完成，分析分离速度快，可对二氢杨梅素产品进行快速分析 检测。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例2在涂覆三（3, 5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉手性固定 相、25°C下，流动相为正己烷/乙醇/三氟乙酸（80 :20 :0. 1，v/v/v)、紫外检测器(波长为 290nm)的条件下得到的二氢杨梅素样品的HPLC谱图。
[0023] 图2为本发明实施例2在涂覆三（3, 5-二甲基苯氨基甲酰化）直链淀粉手性固定 相、25°C下，流动相为正己烷/乙醇/三氟乙酸（80 :20 :0. 1，v/v/v)、旋光检测器的条件下 得到的二氢杨梅素样品的色谱图。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对 本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制。
[0025] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设 备。
[0026] 实施例中，所用的涂覆三（3,5_二甲基苯氨基甲酰化)直链淀粉、三（（S)- (α)_苯 乙基氨基甲酰化）直链淀粉、三（3，5-二甲基苯氨基甲酰