蛋白制剂的高效液相色谱检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白制剂的高效液相色谱检测方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白制剂中，通常需要加入一些辅料，例如：甘露醇作为赋型剂，蔗糖作为稳定剂， 三羟甲基氨基甲烷作为缓冲剂体系。为了控制蛋白制剂的成品质量，通常需要对其组分含 量进行检测；但由于其中含有甘露醇、蔗糖等辅料，检测时各组分之间存在干扰，导致其检 测方法往往比较繁琐、复杂。
[0003]目前，蛋白制剂的检测方法均需要采用两种不同的流动相进行梯度洗脱，实现对 蛋白制剂中各个组分的分离，以避免各组分之间的干扰。例如，柏兆方等采用超高效纳升液 相色谱-电喷雾串联质谱对重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白进行了分析，它 采用特殊的富集柱和分离柱，并采用两种不同的流动相（流动相A:含0. 1%甲酸的水溶液； 流动相B:含0. 1 %甲酸的乙氰）进行梯度洗脱，实现重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体 融合蛋白中各个组分的有效分离，避免各组分之间的干扰（柏兆方，林碧蓉，李萍，李卫华， 刘炳玉，王红霞.《超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定重组人II型肿瘤坏死因子受 体-抗体融合蛋白》.分析化学研究简报，2009年7月，第37卷，第7期：1025~1028.)。
[0004] 姚雪静等建立了一种测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白 含量的方法，也是采用特殊的色谱柱，并采用两种不同的流动相（流动相A液：含0. 1 %三 氟乙酸的水溶液，流动相B液：含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液）进行梯度洗脱（A液从75%渐 变至60%，同时B液从25%渐变至40%，洗脱时间：15min)(姚雪静，李壮林.《RP-HPLC法 测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的含量》.中国药房，2012年， 第23卷，第33期.）。
[0005] 高凯等建立了一种重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的质控方法， 它使用AgilentZorbax300SBC18(5ym，4.6mmX250mm)色谱柱，采用两种不同的流动相 (流动相A液：含0. 1 %三氟醋酸的水溶液；流动相B液：含0. 1 %三氟醋酸的乙腈溶液）进 行梯度洗脱（洗脱梯度为：〇~15min，B液：30%~45% ;16~20min，B液：45%~30% ) (高凯，陶嘉，史新昌，裴德宁，王兰，李响，饶春明，王军志.《重组人B淋巴细胞刺激因子受 体-抗体融合蛋白质控方法和质量标准的建立》.中国生物制品学杂志，2012年3月，第25 卷，第3期.）。
[0006] 可见，现有技术检测蛋白制剂的方法都比较繁琐、复杂，均需要采用两种不同的流 动相进行梯度洗脱，才能实现对蛋白制剂中各个组分的分离。
[0007] 因此，对于蛋白制剂而言，需要发明一种简便并能有效避免各组分之间相互干扰、 实现对各组分有效检测的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供蛋白制剂的一种高效液相色谱检测方法。
[0009] 本发明提供的蛋白制剂的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：
[0010] a、取蛋白制剂，用水溶解后，流动相稀释，制成供试品溶液；
[0011] b、取对照品，用水洛解，制成对照品洛液；
[0012] c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：
[0013] 色谱柱为氨基柱；流动相为乙腈-水溶液，乙腈与水的体积比为（65 :35)~（80: 20)〇
[0014] 进一步的，步骤a中，蛋白制剂为注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合 蛋白。
[0015] 进一步的，注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白包括以下组分： 重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、甘露醇、蔗糖和三羟甲基氨基甲烷。
[0016] 进一步的，注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白包括以下重量份 配比的组分：重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白25份、甘露醇40份、蔗糖10份 和三羟甲基氨基甲烷1.2份。
[0017] 进一步的，步骤a中，供试品溶液的浓度为2. 5mg/ml。
[0018] 进一步的，步骤b中，对照品为甘露醇、蔗糖、重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体 融合蛋白、三羟甲基氨基甲烷中的任意一种或两种以上。
[0019] 进一步的，步骤c中，色谱柱为AgilentZORBAXCarbohydrate，规格为 4. 6_X250mm，填充剂粒径为5μm。
[0020] 进一步的，步骤C中，乙腈与水的体积比为（75 :25)~（80 :20)。
[0021] 进一步的，步骤c中，流动相的流速为1~1. 5ml/min;优选的，流动相的流速为 L5ml/min〇
[0022] 进一步的，步骤c中，色谱柱的柱温为30°C;检测器为示差折光检测器，检测器池 温度为35°C;上样体积为10μ1~20μ1。
[0023] 进一步的，步骤c中，按外标法以峰面积计算供试品中甘露醇、蔗糖、重组人II型 肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白和/或三羟甲基氨基甲烷的含量。
[0024] 本发明蛋白制剂的检测方法，无需采用梯度洗脱程序，就能实现对蛋白制剂中蔗 糖、甘露醇等组分的有效分离，蔗糖和甘露醇之间的分离度高，符合《中国药品检验标准操 作规范2010年版》及《中国药典2010年版》的规定（规定要求大于1. 5)，避免了各组分之 间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法，操作简便、快速，检测结果的准确 性高，非常适合用于对蛋白制剂中甘露醇、蔗糖等组分的定性和定量检测。
[0025] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0026] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0027] 图1、试验例1条件下对融合蛋白制剂的检测结果：(a)供试品溶液；(b)蔗糖对照 品；（c)甘露醇对照品。
[0028] 图2、试验例2条件下对融合蛋白制剂的检测结果：(a)供试品溶液；(b)融合蛋白 原液对照品。
[0029] 图3、试验例3条件下对融合蛋白制剂的检测结果。
[0030] 图4、试验例4条件下对融合蛋白制剂的检测结果。
[0031] 图5、试验例5条件下对融合蛋白制剂的检测结果：曲线1 :供试品溶液，曲线2 :融 合蛋白原液对照品。
[0032] 图6、试验例6条件下对融合蛋白制剂的检测结果：曲线1 :供试品溶液，曲线2 :融 合蛋白原液对照品。
【具体实施方式】
[0033] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0034] 注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白：含有重组人II型肿瘤坏死 因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR:Fc)、甘露醇、蔗糖和三羟甲基氨基甲烷；目前已经上市 的产品有美国辉瑞公司生产的恩利-依那西普、上海中信国健药业生产的益赛普和上海赛 金生物医药生产的强克等。
[0035] 融合蛋白原液：重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白。
[0036] 实施例1
[0037] (1)制备供试品溶液
[0038] 取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1. 0ml超净水复溶 后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2. 5mg/ml;
[0039] (2)高效液相色谱检测
[0040] 采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为10μ1，色谱 条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为 5μm，规格为4. 6mmX250mm;流动相：乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为65 :35 ;流动相的 流速：lml/min;色谱柱温：30°C;检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35°C。
[0041] 实施例2
[0042] (1)制备供试品溶液
[0043] 取注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，用1. 0ml超净水复溶 后，流动相稀释10倍，制成供试品溶液，终浓度为2. 5mg/ml;
[0044] (2)高效液相色谱检测
[0045] 采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测，供试品溶液的上样体积为10μ1，色谱 条件为：色谱柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相为氨基柱；色谱柱的填充剂粒径为 5μm，规格为4. 6mmX250