罂粟成分的实时荧光pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种食品或调味品中磐粟成分的实 时巧光PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 磐粟壳为磐粟科植物磐粟的干燥成熟果壳，具有敛肺止咳、涩肠、止痛的功效，包 含吗啡、可待因、磐粟碱等20多种生物碱。吸食磐粟壳及制品，会使吸食者在屯、理、生理上 成癒，对人体的肝脏、屯、脏等器官产生毒害作用。因此，磐粟壳在我国被列入麻醉药品的范 围予W管制，作为非食用物质，严格禁止在食品及调味品中添加使用。
[0003] 目前磐粟成分检测方法主要集中在对于磐粟来源生物碱成分的检测，方法主要有 薄层层析法、紫外分光光度法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、酶联免疫法。运些方法适用 范围较广，但仅能对磐粟壳食物中残留的生物碱进行间接检测，不能对磐粟物种来源进行 准确定性，不能充分满足对磐粟违禁成分的执法检验和整治监管的需要。因此有必要建立 一种准确客观的检测磐粟成分的新方法。
【发明内容】
[0004] 本发明首要目的在于提供一种磐粟成分的实时巧光PCR检测方法，W克服现有技 术所存在的上述缺点和不足。本发明的第二个目的在于提供一种检测试剂盒，W及检测试 剂盒的应用。本发明的第Ξ个目的在于提供一种磐粟成分实时巧光PCR的引物对和探针。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0006] 作为本发明的第一个方面，一种磐粟成分的实时巧光PCR检测方法，该方法包括 W下步骤：
[0007] 步骤一：W磐粟种子的DNA为模板，进行巧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物； [000引步骤二：检测扩增产物的巧光信号；
[0009] 其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增磐粟成分的特异性引物对和磐粟成分 的特异性探针，所述扩增磐粟成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 所示，所述磐粟成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 根据本发明，所述PCR扩增的条件如下：
[0011] 反应体系为：2XTaqManMastermix12. 5yL，引物各 1. 25yL，探针 0. 5yL，d地2〇 4. 5μLDM模板 5μL;
[001引反应的条件为：50°C，2min;95°(：，10111111，90°(：，103,60°(：，1111111，45个循环。
[0013] 作为本发明的第二个方面，一种磐粟成分的检测试剂盒，含有W下试剂：
[0014] (a)扩增磐粟成分的特异性引物对；
[0015] 化）磐粟成分的特异性探针；
[0016] 其中，所述扩增磐粟成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 所示，所述磐粟成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0017] 根据本发明，所述检测试剂盒还包括：
[001引 （C)标准参照物。
[0019] 本发明的检测试剂盒可用于检调味品或食品添加剂中的磐粟成分。
[0020] 作为本发明的第Ξ个方面，所述特异性引物对的序列如SEQIDNO. 1和SEQID NO. 2所示，所述特异性探针的序列如SEQIDNO. 3所示。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 1、可快速、简便地检测调味品中是否存在磐粟成分；
[0023] 2、其特异性好，且灵敏度高，特别适用于各类调味料中非法添加磐粟成分的检测。
【附图说明】
[0024] 图1为实时巧光PCR引物特异性试验扩增曲线图。
[002引图2为实时巧光PCR灵敏度试验扩增曲线图。
[002引图3为实时巧光PCR检出限试验扩增曲线图。
[0027] 图4为8种调味料实时巧光PCR扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0028]W下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，W下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。本发明的实验材料和仪器如下：
[002引（1)桂皮、八角、香叶等7种调味料，海底拱清汤火锅底料、烛肉料、排骨鲜味王等8 种复合调味料均为市售产品；
[0030] (2)磐粟种子为市售产品；
[0031] (3)鱼腥草、金银花、紫花地下等36种药材，与磐粟具有同源性，均为市售产品；
[0032] (4)TianGenDP-305植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生物有限公司OlANGEN BIOTECH度EIJING)CO.，LTD,Beijing,China);
[003引 （5)TianGenDP-326深加工食品DM提取试剂盒购自天根生物有限公司OlANGEN BIOTECH度EIJING)CO.，LTD,Beijing,China);
[0034] (6)引物和探针由辉瑞公司合成（Pfizer,Inc.NYSE:P阳，USA);
[0035] (7)TaqManGeneExpressionMasterMix(货号：4369016)试剂均购自Applied Biosystems公司(AppliedBiosystemsInc. ,USA)；
[0036] (8)试验相关仪器：液氮冷冻研磨仪SPEX6580(S阳X，USA);紫外分光光度计 NanovuePlus(GEHealthcare,UnitedKingdom);实时巧光PCR仪ABIViia7(Applied BiosystemsInc.，USA);实时巧光PCR仪ABI7300(AppliedBiosystemsInc.，USA);核酸 蛋白分析仪；分析天平；离屯、机。
[0037] 实施例1磐粟及香辛料、药材的DNA的提取
[0038] (1)固体样品：取25g磐粟种子，用液氮冷冻研磨仪研磨粉碎，称取200mg磐粟种 子粉末至离屯、管中。
[003引 似液体样品：称取250g磐粟种子，倒入500血的分液滤斗中，静置1-2小时，样 品会分为3层，上层是油脂，中间是水化下层是固体残渣。残渣处理：将残渣分离到100ml烧杯中，取部分残渣到研鉢或者研磨仪中，研磨粉碎，取ImL至2ml的离屯、管中。水相处理： 残渣分离后往分液滤斗中加入lOOmL石油酸，震荡5分钟后静置，收集下层水相，采用大体 积浓缩仪（40~60°C+抽真空+低速离屯、）浓缩至1-5血，取1血至2血的离屯、管中。
[0040] (3)采用TianGen DP-305植物基因组DNA提取试剂盒灯ianGen DP305-02)对桂 皮、八角、香叶等7种香辛料和鱼腥草、金银花、紫花地下等36种药材进行提取。
[0041] (4)采用TianGen DP-326深加工食品DNA提取试剂盒对海底拱清汤火锅底料、烛 肉料、排骨鲜味王等8种复合调味料进行提取。
[00化|上述（1)~（4)的DNA浓度采用紫外分光光度仪NanovuePlus测定，模板量控制 在30ng/反应W上，0D260/280控制在1. 8至2. 0之间