转基因玉米mir604双重数字pcr荧光定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体地说，涉及转基因玉米MIR604双重数 字PCR荧光定量检测方法。
【背景技术】
[0002] 自1996年首例转基因番茄在美国成功商业化以来，对于转基因作物的研究近 二十年来取得了迅速的发展。根据ISAAA统计数据，截至2014年，全球转基因作物的种植 面积已经达到1. 8亿公顷，比1996年种植面积提高了近100倍，占全球作物种植总面积的 3. 4%。转基因作物的快速发展不仅为现代农业提供了更加便利的育种方式，也由于其未知 的安全隐患引起了各个国家和地区的广泛关注。为此，各国家和地区纷纷建立起转基因成 分的标识制度。在全球各国家和地区制定的转基因成分标识制度中，定量标识制度占据较 大比重，其中以欧盟和日韩最具代表性。我国在转基因成分标识方面主要采取定性标识制 度，由于定性标识制度与定量标识制度在检测技术等方面存在不同，使我国在作物进出口 方面容易受到国际标准的制约。为此，我国需要大力发展转基因成分定量检测技术并建立 相关定量标识制度。
[0003] 数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的绝对定量PCR检测方法，是一项检测和定 量核酸的新技术，其基本原理是通过将微量样品进行大倍数稀释和分液，直至每个样品中 所含有的待测分子数不超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，有PCR扩增 荧光信号记为1，无荧光信号记为0,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分 子，针对反应结果采用泊松分布（Poissondistribution)公式，便可计算出样本的最初 拷贝数或浓度。该技术不依赖于扩增曲线的循环阈值，也无需看家基因和标准曲线，即可 实现DNA绝对定量。该技术在基因拷贝数变化分析（copynumbervariation,CNV)(Qin etal.，2008)、遗传突变检测（Yungetal.，2009)、基因分型（Loetal.，2007)、基因定 量（Warrenetal.，2010)、单细胞基因表达（Guoetal.，2010)等方面的研究取得了突破 性的发展，在临床方面为癌症、肿瘤等疾病检测提供了新的诊断方法。在转基因检测方面， Corbisier等（2010)利用数字PCR分析了玉米种子DNA中外源基因和内参基因的拷贝数之 比，该结果与利用普通荧光定量PCR技术以质粒DNA为标准物质检测的结果相同，证明了数 字PCR的可靠性。Burns等（2010)评估了数字PCR在转基因检测中检测限（L0D)和定量限 (L0Q)，探索了数字PCR在转基因检测方面的可行性和反应条件，表明数字PCR能够对起始 模板拷贝数进行绝对定量。然而利用数字PCR对转基因检测的研究还处于起步阶段。现有 数字PCR检测方法都需要经过样品前处理过程，在实际检测中，前处理过程往往会导致实 验结果产生偏差。因此现有的数字PCR检测方法不适合直接作为转基因成分的检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种不需要进行样品前处理步骤的，针对转基因玉米MIR604 的双重数字PCR荧光定量检测方法，可实现对转基因玉米品系MIR604的绝对定量。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明首先提供用于转基因玉米MIR604双重数字PCR荧光 定量检测的引物和探针组合，所述引物和探针组合为：
[0006]外源基因正向引物：5' -GCGCACGCAAITCAACAG-3'
[0007]外源基因反向引物：5' -GGTCATAACGTGACTCCCTTAAITCT-3'
[0008]外源基因探针：5'-FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-BHQ1-3'
[0009]内参基因hmga正向引物：5' -TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'
[0010]内参基因hmga反向引物：5' -GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3'
[0011] 内参基因hmga探针：5' -VIC-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-BHQ1-3'。
[0012] 本发明还提供含有所述引物和探针组合的转基因玉米MIR604数字PCR双重荧光 定量检测试剂盒。
[0013] 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳 性模板等中的至少一种。
[0014] 本发明进一步提供转基因玉米MIR604双重数字PCR荧光定量检测方法，所述方法 包括以下步骤：
[0015] 1)提取待测样品的基因组DNA;
[0016] 2)以提取的基因组DNA为模板，利用所述的引物和探针组合，进行数字PCR扩增反 应；
[0017]3)检测PCR扩增产物。
[0018] 其中，数字PCR扩增反应的反应体系以4yl计为：基因组DNAlyl，225nM外 源基因正、反向引物各0. 04yl，225nM内参基因正、反向引物各0. 04yl，50nM外源基因 探针 0? 02yl，50nM内参基因探针 0? 02yl，2XMasterMix(购自Fluidigm公司）2y1， 20XLoadingReagent(购自Fluidigm公司）0? 4y1，ddH20 补足至 4y1 〇
[0019] 数字PCR扩增反应的程序为：50°C热激活300s;95°C预变性300s;95°C变性15s， 60°C退火及延伸60s，共50个循环；在60°C下采集荧光信号。
[0020] 前述的方法，步骤3)中检测PCR扩增产物具体如下：在数字PCR扩增反应结束后， 记录各反应孔中外源基因和内参基因的荧光信号值，通过泊松分布公式计算各反应孔中外 源基因与内参基因的拷贝数，通过两者的拷贝数之比得到转基因成分的绝对浓度。
[0021] 本发明是在PCR芯片中进行数字PCR扩增反应。将每个加样孔作为一个整体，加入 转基因作物数字PCR扩增体系进行实时荧光扩增，通过监测每个反应孔中的荧光信号值， 获得所有反应孔中的总体扩增曲线和热点图。
[0022] 检测结果的判定按照以下方式进行：
[0023] 1、在利用数字PCR进行扩增的过程中，阳性孔的判定方法为：出现明显区别于阴 性反应孔（阴性反应孔中模板为1y1ddH20)的扩增信号，将该反应孔记为阳性扩增孔；阳 性样品的判定方法为：在相同样品的三个平行组内，至少出现一组有阳性扩增孔，则表明检 测样品基因组中含有转基因作物成分；
[0024] 2、在数字PCR扩增结束后，记录每个扩增孔中外源基因和内参基因的亮点数，通 过泊松分布公式计算每个孔中外源基因与内参基因的拷贝数，通过两者的拷贝数之比得到 转基因成分的绝对浓度；
[0025] 3、每个样品设置三个平行组，通过统计分析得到三个平行组内转基因成分浓度的 相对标准偏差（1?0)，1?0<25%表明定量结果有意义；
[0026] 4、当待测样品反应孔中为阴性结果时，表明未检测到转基因作物成分；当待测样 品反应管中为阳性结果时，表明待测样品中含有转基因作物成分。
[0027] 本发明方法可以直接对待检测样品的基因组中的转基因玉米MIR604进行定量检 测，从而省去了现有的数字PCR方法中的样品前处理步骤，使得检测过程简便易行，避免了 前处理步骤对检测结果准确性的不良影响。另外，在本发明方法中，由于转基因成分是通过 外源基因拷贝数与内参基因拷贝数的比例计算得到的，因此在同一个反应体系进行双重检 测可以提尚转基因成分定量检测的稳定性。
[0028] 利用本发明提供的双重数字PCR荧光定量检测方法和检测试剂盒可以实现对转 基因玉米MIR604的绝对定量检测，本方法定量检测限可达到0. 5%，灵敏度可达到0. 1%， 能够满足转基因成分实际检测的需要。此外，本方法操作简单，灵活性强，是一种转基因绝 对定量检测的有效方法。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明实施例2中转基因玉米MIR604外源基因引物探针与不同内参基 因引物探针组合的扩增效果图；其中，A为与内参基因adhl-70bp组合，B为与内参基因 adhl-135bp组合，C为与内参基因hmga-79bp组合，D为与内参基因zssllb-88bp组合。
[0030] 图2为本发明实施例2中转基因玉米MIR604品系特异性检测结果；其中，横坐标 为不同转基因玉米品系，纵坐标为利用双重数字PCR法扩增得到的外源基因拷贝数。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实 施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0032] 实施例1用于转基因玉米MIR604双重数字PCR荧光定量检测的引物和探针组合 的设计
[0033] 根据转基因玉米MIR604品系外源基因插入序列及边界序列设计了如下用于转基 因玉米MIR604双重数字PCR荧光定量检测的引物和探针组合（SeqIDNo. 1-6):
[0034]外源基因正向引物：5' -GCGCACGCAAITCAACAG-3'
[0035]外源基因反向引物：5' -GGTCATAACGTGACTCCCTTAAITCT-3'
[0036] 外源基因探针：5'-FAM-AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-BHQ1-3'
[0037]内参基因hmga正向引物：5' -TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'
[0038]内参基因hmga反向引物：5' -GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3'
[0039] 内参基因hmga探针：5' -VIC-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-BHQ1-3'。
[0040] 实施例2转基因玉米MIR604双重数字PCR定量检测方法的建立
[0041] 1.1实验材料
[0042] 本实施例中使用的转基因玉米MIR604样品及其亲本非转基因样品，转基因玉米 品系NK603、M0N810、Btl76、MIR162、3272、M0N863均由中国检验检疫科学研究院提供。PCR 芯片购自美国Fluidigm公司，型号为48. 770DigitalArrayChip;BioMarkHD高通量基 因分析系统（BiomarkHDSystem)购自Fluidigm公司。
[0043] 1. 2实验用转基因作物种子样品基因组DNA提取
[0044] (1)将作物种子样品研磨并彻底风干；
[0045] (2)将转基因玉米品系与亲本非转基因种子样品进行不同比例的混合，并通过混 匀仪器的过夜混匀得到实验用的不同转基因浓度的样品；
[0046] (3)用分析天平称取100mg样品，加入400yLAPI缓冲液以及4yL的RNaseA， 剧烈震荡混匀后，65°C下水浴20min，期间震荡混匀2-3次；
[0047] (4)