一种利用双重PCR技术检测Cf-9和 I-2基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种快速、简捷、高效的同时检测抗病基因 Cf-9和1-2的方法，属植 物保护技术领域。
【背景技术】
[0002] 番前是世界上重要的蔬菜作物，自上个世纪50年代番前枯萎病 f. sp.心被首次报道以来，现已遍及世界各地，并已经成为危 害番茄生产的主要病害之一。目前已发现的抗枯萎病的基因主要有三个分别为1-1、I -2 和1-3。在番前抗病育种中，由于基因同时抗小种1和2，因而尤其受到重视。
[0003] 关于1-2基因的分子标记研宄，早在上个世纪90年代，国外就了报道1-2基因的 RFLP分子标记。由于RFLP标记操作复杂，成本高，且一般存在放射性污染。因而，该 标记不适合用于标记辅助育种。随着分子生物学技术的发展，目前已分离的番茄抗病基因 达9个，其中包括了抗枯萎病的1-2基因和1-2 C基因，这一研宄为抗枯萎病功能标记 的开发奠定了良好基础。于拴仓等人根据番茄枯萎病抗病基因 1-2的碱基序列，设计特异 扩增引物，发展基于基因序列标签的功能标记，为番茄枯萎病抗病基因 1-2的分子标记 辅助育种奠定基础。
[0004] 番茄生产上经常发生的另一种病害就是番茄叶霉病。叶霉病对保护地番茄生产危 害尤为突出。随着保护地番茄种植面积的扩大及连作时间的延长，该病的危害也日趋严 重。番茄叶霉病发病率很高，此病一旦出现，迅速传播蔓延。番茄叶霉病给番茄生产带来 了不可低估的影响。
[0005] 在育种中，1-2和Cf-9被认为是主效基因，为了提高番茄对这两种病的抗性，育种 工作者可同时将这两个基因通过有性杂交的方式导入某个品种。而在杂交后代群体中选择 出两个基因合一的符合育种目标的个体是一个耗时、耗力的过程。由于受时间、环境和地域 限制较少，所以应用不同的分子标记对抗病基因进行辅助选择，可以大幅度提高所需品种 选择的准确性和选择效率，缩短育种年限。
[0006] 目前已开发出分别检测这两个基因的分子标记，能够区分抗病、感病材料。未见在 一个反应体系中对1-2和Cf-9标记进行多重PCR的报道。
【发明内容】
[0007] 本试验探索通过多重PCR在同一个反应中完成两个标记的扩增，为番茄抗性育 种分子标记相关研宄提供一种更加省时、省力、经济有效的方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案： 一种利用双重PCR技术检测Cf-9和1-2基因的方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) DNA提取：取番茄植株的叶片，提取总DNA ; (2) 引物的设计与合成：双重PCR所用引物1-2/5引物来自于拴仓设计的引物(于拴仓， 遗传，2008年7月，30(7): 926 - 932); Cf-9D1/D2依孙亚林（孙亚林.2008.番茄四 个抗病基因的基因标记的创建与辅助选择[硕士论文].武汉：华中农业大学)设计的引物
(3)单管PCR扩增 PCR总体积为25 μ L，其中包括IOX反应缓冲液(含Mg2+)2. 5 μ L，dNTP( each IOmmol/ 1〇14 1，上游引物（10以111〇1/1)2.5 41^下游引物（10 41]1〇1/1)2.5 41^模板0嫩（14 1/ 41^)0.5-2 41^，丁&9酶（5"41^)0.5 41^，其余用水补足。
[0009] 反应程序：94 °C变性 2 min ;94 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C I. 5 min，35 个 循环；72 °C延伸10 min。
[0010] (4)双重PCR扩增：各体系引物体积比
PCR反应其它参数采用以下体系进行扩增： 模板 DNA (ΙμΙ/yL )2yl，dNTP (each 10mmol/L)lyl，10XBufTer 2.5yl，Taq 酶（5U/μ L) 0.5 μ 1，加 ddH20 至 20 μ 1。
[0011] 扩增 PCR 反应程序为：94°C变性 5min ;然后 94°C，30sec、57°C，lmin、72°C， 2min 30sec，进行30个循环；最后72°C延伸10min，4°C保温。
[0012] (5 )双重PCR扩增体系： 实验对Cf-Dl/D2和I-2/5F/R两对引物进行了引物配比，最终确定体系为： 模板 DNA (ΙμΙ/yL )2yl，dNTP (each 10mmol/L)lyl，10XBufTer 2.5yl，Taq 酶（5U/yL)0.5yl，引物浓度分别为 Cf-Dl/D2 (ΙΟμΜ)为 2μ1，I-2/5F/R (ΙΟμΜ)为 0·5μ1，加 ddH20 至 20μ1，扩增 PCR 反应程序为：94°C变性 5min;然后 94°C，30sec、 57°C，lmin、72°C，2min 30sec，进行 30 个循环；最后 72°C延伸 10min，4°C保温。
[0013] 本发明更加详细的描述如下： 1材料和方法 1. 1材料 供试品种为西安金鹏种苗有限公司的抗枯萎病和叶霉病的品种M158和北京银月亮科 技有限公司的HL108的F2单株。
[0014] 方法 I. 2. I DNA提取取番茄植株的叶片，按王关林的CTAB法提取总DNA(王关林，植物基因 工程，第2版，北京：科学出版社，2002)。
[0015] 1. 2. 2引物的设计与合成根据于拴仓等人(遗传，2008年7月，30(7) : 926 - 932)设计的一对引物用来检测1-2基因，依孙亚林(孙亚林.2008.番茄四个抗病基因的 基因标记的创建与辅助选择[硕士论文].武汉：华中农业大学）设计的引物，用于扩增 Cf-9分子标记片段。引物序列分别如表1。
[0016] 表1双重PCR所用引物
注：含有Cf-9基因的材料能扩出514bp大小的条带，不含有该基因的材料不能扩出该 条带；含有1-2基因的材料能扩出630bp的条带，不含有1-2基因的材料能扩出690bp的条 带。
[0017] 1.2.3 单管 PCR 扩增 PCR总体积为25 μ L，其中包括IOX反应缓冲液(含Mg2+)2. 5 μ L，dNTP( each IOmmol/ 1〇14 1，上游引物（10以111〇1/1)2.5 41^下游引物（10 41]1〇1/1)2.5 41^模板0嫩（14 1/ 41^)0.5-2 41^，了&9酶（5"41^)0.5 41^，其余用水补足。反应程序：94°〇变性2 1^11 ;94 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C I. 5 min，35 个循环；72 °C延伸 10 min。
[0018] 1. 2. 4 双重 PCR 扩增 影响双重PCR体系的因素很多，其中最主要的就是引物的配比。
[0019] 在本实验中利用正交实验设计不同的引物配比。其它因素一致，只是修改引物在 体系中的浓度。最终选择的是体系4即Cf和12引物体积分别为(浓度为10 μ M) 2 μ L和 0. 5 μ L0
[0020] 表2 :各体系引物体积比比 双重PCR扩增：各体系引物体积比 体系名称 引物 体积比（10μΜ)μL
PCR反应其它参数采用以下体系进行扩增： 模板 DNA (ΙμΙ/yL )2yl，dNTP (each 10mmol/L)lyl，10XBufTer 2.5yl，Taq 酶（5"4 1〇0.5以1，加（1(1!120至2(^1。
[0021] 扩增 PCR 反应程序为：94°C变性 5min ;然后 94°C，30sec、57°C，lmin、72°C， 2min 30sec，进行30个循环；最后72°C延伸10min，4°C保温。
[0022] 结果与分析 2. lCf-9扩增结果 对供试的两个市售品种，利用Cf-Dl/D2进行单引物PCR扩增，结果这2份材料均扩增 出了约500bp的条带（图1)。
[0023] 扩增结果 同样对这2份材料，利用I-2/5F/R进行单引物PCR扩增，结果表明早魁扩出了 690bp 的条带；M158扩增出了 630bp的条带（图2)。这说明HL108-F2不含有1-2 ;M158含有1-2 基因。
[0024] 双重PCR扩增体系扩增结果： 为了获得可以同时对这两个基因进行筛选的PCR扩增反应体系，以金棚158为材料，在 原各自单引物的PCR扩增体系的基础上，将Cf-Dl/D2和I-2/5F/R两对引物合在同一管，结 果只扩增出了较大的条带I-2/5F/R，较小的条带未得到扩增（图3泳道2)。鉴于此，在其它 反应参数不变的基础上，调整引物的配比，分别做了 Cf和12引物浓度为10 ymol/L体积为 为2yL :1. 5yL和2yL :1 yL的双重PCR扩增体系。通过电泳图可以看出随着两对引物浓 度配比的变化，该条带扩增也逐渐显现出来（图3,泳道3泳道4)。在扩增体系4中即引物配 比为2 μ L : 1 μ L时，两条目的条带均得到了扩增但较小的条带仍较浅（图3,泳道4)