Top2a基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
【专利说明】T0P2A基因表达量黄光定量PCR检测试剂盒及其应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种人拓扑异构IIαΟ?Ρ2Α)基因巧光定量PCR检测试剂盒及其应 用。 (二）【背景技术】
[0002] 拓扑异构酶（Topoisomerase，TOP)是存在于细胞核内的一类酶，能够催化DNA链 的断裂和结合，从而抑制DNA的拓扑状态。哺乳动物主要存在两种拓扑异构酶，拓扑异构酶 I通过形成短暂的单链裂解结合环，催化DNA复制的拓扑异构状态的变化。相反拓扑异构酶 II引起瞬间双链酶桥的断裂，然后开通和再封闭，W改变DNA的拓扑状态。拓扑异构酶II 又包括TOPIIa和TOPΙΙβ两种同工酶。TOPIIa的编码基因为T0P2A，位于17ql2.21。 T0P2A在快速增殖细胞中含量最高，其表达仅限于S期到G2/M期的细胞周期。TOPIIa在 分化差的肿瘤组织中的表达明显高于分化良好的肿瘤组织，在正常组织中则很少表达，运 使得它可能成为抗肿瘤治疗的有效祀点。
[0003] 临床上的拓扑异构酶II抑制剂就是针对该祀点的抗肿瘤药物。拓扑异构酶II抑 制剂根据作用方式不同分为嵌入型和非嵌入型两类。嵌入型抑制剂系通过其分子中类似嚷 岭碱或喀晚碱的多环结构嵌入到拓扑异构酶II与DNA结合部位的双链之间，从而干扰了酶 将DNA断端重新接合的正常功能，并进一步造成DNA链断裂损伤，导致细胞死亡。运一类药 物主要有：叮晚类（m-AMSA)，蔥环类（阿霉素、柔红霉素等），蔥二酬类（米托蔥酿、蔥双咪 腺）。非嵌入性抑制剂的作用模式尚不清楚。
[0004] 研究表明，T0P2A基因异常对蔥环类药物化疗的疗效有预测作用。有淋己结转移的 乳泉癌患者被随机分成CEF化疗组和CNM化疗组，分析T0P2A和化疗疗效的关系。结果显 示，T0P2A基因变异（扩增或缺失）的乳腺癌患者，接受CEF化疗者的RFS(皿=0. 3,P= 0. 005)和0S化R= 0. 33,P= 0. 008)明显优于CMF组；相反T0P2A基因无变异的患者，CEF 和CMF的疗效之间并无无明显的差别。在一项分析5000例乳腺癌者肥R-2和T0P2A基因 改变与化疗疗效关系的试验中，发现单纯使用AC方案化疗，肥R-2和T0P2A基因同时高表 达的患者生存明显优于仅有肥R-2基因高表达组（P= 0. 004)，因此，认为T0P2A基因扩增 可预测乳腺癌含蔥环类化疗药物的疗效。对278例乳腺癌患者的研究表明，T0P2A基因表 达的乳腺癌患者中pCR率要明显高于T0P2A未表达的患者（P<0. 0001)。ΜΕΤΑ分析也同样 证明，Τ0Ρ2Α基因扩增可作为乳腺癌含葱环类化疗疗效的预测因子。运些研究结果均提示 我们在乳腺癌患者中，TOP2Α基因变异与葱环类辅助化疗的作用有一定的关联，可作为药 物选择的参考。 (Ξ)
【发明内容】
阳0化]本发明目的是提供一种人T0P2A基因巧光定量PCR检测试剂盒，用于检测人T0P2A基因的表达，特异性好，灵敏度高。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 一种检测人T0P2A基因突变的巧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR 反应试剂；所述特异性引物序列如下：
[0008] 上游引物：5，-GGGAGAGTGATGACTTCCATATGGA-3 '
[0009] 下游引物：5 ' -AACACCTTCCCCAAACTAAATTCAG-3，。
[0010] 所述PCR反应试剂为本领域常规试剂，主要包括：dNTP、反转录缓冲液、PCR缓冲 液、Mg2\双蒸水、逆转录酶、Tag酶等，也可直接采用市售PCRMix成品。
[0011] 所述试剂盒还可包括人T0P2A基因检测标准品，所述标准品序列如下：
[0012] 5'-AATGTGAGGCGATTATTTTAAGTAATTATCTTACCAAGCCCAAGACTGGTTTTAAAGTTACCTG AAGCTCTTAACTTCCTCCCCTCTGAATTTAGTTTGGGGAAGGTGTTTTTAGTACAAGACATCAAAGTGAAGTAAA GCCCAAGTGTTCTT-3>。
[0013] t不准品的制备：WGenebank中发布的人T0P2A的基因序列为柄；准，W健康体检 人的外周血mRNA为模板，反转录为cDNA。W该cDNA为模板，用上述引物扩增出特异性的 PCR片段，然后把该PCR片段插入到T载体中，利用大肠杆菌D册α菌株转化并提取质粒， nano化ορ2000测定浓度和纯度，W此质粒作为检测分析中的标准品。
[0014] 本发明还设及所述的试剂盒在检测人Τ0Ρ2Α基因表达量中的应用。
[0015] 具体的，所述应用方法如下：
[0016] (1)采集待测样本，提取RNA;样本可W是血液、穿刺组织、石蜡组织、手术切除组 织等；
[0017] (2)W样品RNA为模板，进行反转录反应，得到样品cDNA; 阳018] 反转录反应：RNA模板0.lug,反转录反应试剂（promega试剂盒），双蒸水；反转录 反应：25°C15min;50°CIhour;85°C5min;4°C，5min。
[0019] (3)w梯度浓度的人T0P2A基因检测标准品为模板，加入所述特异性引物和PCR反 应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，绘制标准曲线； W20] (4)W样品cDNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反 应体系，进行PCR扩增，扩增结果对照标准曲线，获得T0P2A基因表达量。可W样 品cDNA为模板，加入内参 18s特异性引物（F:5' -AGAAACGGCTACCACATCCA-3';R: 5' -CACCAGACTTGCCCTCCA-3')和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，监控实 验体系的可行性。 阳02U 所述PCR反应条件如下：95°C预变性2min;95°C变性15s、60°C退火20s、72°C延伸 20s(此处收集巧光信号），40个循环。
[0022] 本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒用于检测人T0P2A基因表达量，特 异性好，灵敏度高，具有较好应用前景。 (四）
【附图说明】
[0023] 图1为标准曲线及3对（癌组织和癌旁组织）临床样本的检测结果；
[0024] 图2为内参18s的扩增曲线。 (五）
【具体实施方式】
[00巧]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此： 阳0%] 实施例1:
[0027] (1)样品准备：取患者手术切除组织，提取RNA(浓度不小于l(K)ng，A260/280不小 于 1. 9)。
[0028] (2)样品处理：取lOOng的RNA，加入反转录试剂（promega试剂盒）5μ1，补双蒸 水到20μ1，按如下条件进行反转录反应：25°C15分钟；50°C1小时；85°C5分钟；4°C，5分 钟。
[0029] (3)巧光定量PCR反应：
[0030] 利用（2)中反转录产物为模板进行：取上述反转录模板5μ1，加入0. 1ml的8联 排管中（含巧光定量PCR反应试剂15μ1)。同时在标 阳03U 准管中（含巧光定量PCR反应试剂15μ1)加入相应梯度浓度的标准品；在内参管 (含巧光定量PCR反应试剂15μ1，引物为内参18s特异性引物）中加入5μ1上述cDNA模 板。混匀。然后加入巧光定量反应引物，上机检测。在ABISt巧化ePlus仪器上，选择标 准曲线法和SYBR染料，进行PCR反应；
[0032]巧光定量PCR反应试剂组成如下：总体积：15 μ 1 ;PCR Mix值BI Bioscience) (10 μ1)引物集（0. 2 μ1)，双蒸水（4.8 μ1); 阳03引？〇?反应条件如下：95°(：预变性2111111;95°(：变性153、60°(：退火203、72°(：延伸 20s(此处收集巧光信号），40个循环。
[0034] (4)结果判读。根据标准品建立标准曲线，利用待测样品的Ct值，从该曲线上读取 相应的T0P2A基因表达量，结果参见图1，内参18s的扩增曲线参见图2 ;由图可见：本发明 试剂盒可用于检测人T0P2A基因表达量，特异性好，灵敏度高。
【主权项】
1.检测人T0P2A基因突变的荧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反应试 剂；其特征在于所述特异性引物序列如下： 上游引物：5' -GGGAGAGTGATGACTTCCATATGGA-3' 下游引物：5' -AACACCTTCCCCAAACTAAATTCAG-3'。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括人T0P2A基因检测标准 品，所述标准品序列如下： 5' -AATGTGAGGCGATTATTTTAAGTAATTATCTTACCAAGCCCAAGACTGGTTTTAAAGTTACCTGAAGC TCTTAACTTCCTCCCCTCTGAATTTAGTTTGGGGAAGGTGTTTTTAGTACAAGACATCAAAGTGAAGTAAAGCCCA AGTGTTCTT-3'。3.权利要求1所述的试剂盒在检测人T0P2A基因表达量中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用方法如下： (1)采集待测样本，提取RNA ; (2)以样品RNA为模板，进行反转录反应，得到样品cDNA ; (3)以梯度浓度的人T0P2A基因检测标准品为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试 剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，绘制标准曲线； (4)以样品cDNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进 行PCR扩增，扩增结果对照标准曲线，获得T0P2A基因表达量。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述PCR反应条件如下：95°C预变性2min ; 95°C变性15s、60°C退火20s、72°C延伸20s，40个循环。
【专利摘要】本发明涉及一种检测人TOP2A基因突变的荧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反应试剂；所述特异性引物序列如下：上游引物：5’-GGGAGAGTGATGACTTCCATATGGA-3’下游引物：5’-AACACCTTCCCCAAACTAAATTCAG-3’；本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒用于检测人TOP2A基因表达量，特异性好，灵敏度高，具有较好应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105256023
【申请号】CN201510671926
【发明人】刘小龙, 张云, 杨福太, 高运臻, 李雨阳
【申请人】苏州贝斯麦医疗仪器有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月16日