专利名称：检测her2基因表达水平的实时荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种PCR试剂盒，尤其是涉及一种检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒。
背景技术：
乳腺癌是女性第二大常见肿瘤，发病率仅次于非黑色素瘤皮肤癌，是导致患癌症妇女死亡的第二大主要原因，其发病率约占全部女性恶性肿瘤的16%，且它的发病常与遗传有关，据流行病学调查发现，59TlO%的乳腺癌是家族性的。20 世纪以来，乳腺癌的发病率在世界各地均有上升的趋势，据资料统计，仅2008年全球乳腺癌死亡人数就高达458，503人，占女性恶性肿瘤死亡人数的 13. 7%(Boyle P，Levin B. World Cancer Report 2008 [M].France :IARC, 2008)。近年来，我国女性乳腺癌的发病率也正以每年3% 4%的增长率急剧上升，每年约有20余万妇女患乳腺癌，其中，约209^30%的乳腺癌患者为人类表皮生长因子受体-2 (Her2/neu)阳性乳腺癌。Yang 等(Yang L, Parkin DM, Ferlay J, et al. Estimates of Cancer Incidencein China for 2000and Projections for 2005[J]. Cancer Epidemiol BiomarkersPrev, 2005, 14:243-250)根据全国肿瘤死亡率监测资料预测，我国女性乳腺癌的发病率将从2000年的19.9 / 10万上升到2005年的24. 8 / 10万。近年来的研究也发现，我国女性乳腺癌的发病年龄正趋于年轻化，近四成患者在4(T49岁之间被诊断为乳腺癌，这部分患者可能在治疗过程中经历绝经过程，这一特点与欧美国家三分之二以上患者发病时已经绝经形成鲜明对比，由中国癌症基金会发起的中国首个大规模乳腺癌流行病调研项目一 “中国乳腺癌流行病学调研项目”在2011年发布的整体调研结果显示，我国女性乳腺癌病人发病的中位年龄为48岁，比西方提早了 10年，因此乳腺癌的早期诊疗研究对于我国乃至全球女性生命健康具有非常重要的意义。HER2是原癌基因人类表皮生长因子受体_2 (Human Epidermal Growth FactorReceptor-2)基因，即c-erbB-2基因，定位于染色体17ql2_17q21上，编码相对分子质量为185kDa的跨膜受体样蛋白，具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体，由胞外区(ECD)、跨膜区(TM)和胞内区(ID)三部分构成，胞外区主要由2个配体结合域(RLD)与 2 个富含半胱氨酸区构成(Lohrish C，Piccart M. An overview of HER-2[J]. SeminOncol, 2001, 28:3-11)。1987 年，Slamon 等(Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al. Human BreastCancer:Correlation of Relapse and Survival with Amplification of the HER2/neu oncogene [J], Science, 1987，235 (4785) : 177-182)在对 189 名人乳腺癌患者的研究中，首次报道了 J1ER2基因在乳腺癌细胞中的表达，指出HER2基因在乳腺癌的生物学行为和发病机制中有重要作用，并认为J1ER2基因的扩增水平是比雌激素受体、肿瘤大小等更有价值的预后指标。此后，Ross 等(Ross JS, Fletcher JA. The HER-2/neu Oncogene inBreast Cancer-Prognostic Factor, Predictive Factor and Target for Therapy[J].Stem Cells, 1998，16:413-428)对涉及15248例病人的47组试验进行了回顾性研究，结果显示，对60%的试验组和67%的病人来说，HER2基因的扩增水平可以作为判断乳腺癌预后的独立指标。Schmidt 等(Schmidt M, Lewark B，Kohlschmidt N，et al. Long-termPrognostic Significance of HER-2/neu in Untreated Node-negative Breast CancerDepends on the Method of Testing [J]. Breast Cancer Res, 2005，7:256-266)通过对未经任何治疗的淋巴结阴性乳腺癌患者HER2状态的研究，发现HER2基因扩增比Her2蛋白表达对于预后的意义更加明确，因此，他们认为HER2基因扩增可作为一个独立的预后因子。Mrhalova 等(MrhalovdM, KodetR, KalinovdM,et al. Relative Quantification of ERBB2mRNA in Invasive Duct Carcinoma of the Breast: Correlation with ERBB—2 ProteinExpression and ERBB2 Gene Copy Number[J]. Pathol Res Pract, 2003, 199(7):453-461)通过对39例浸润性导管癌进行研究，发现HER2基因mRNA的表达水平(荧光定量逆转录PCR法Q-RT-PCR)与HER2蛋白表达水平(免疫组织化学法，IHC)及HER2基因拷贝数水平(荧光原位杂交法，FISH)存在较好的一致性，且在可疑病例的判断中有较出色的表现。Celine Bossard 等(Bossard C，Bieche I, Doussal VL, et al. Real-time RT-PCR:AComplementary Method to Detect HER-2 Status in Breast Carcinoma[J]. Anticancer Res, 2005, 25:4679-4684)也通过44例浸润性乳腺癌的研究证实了 Mrhalova等的研究，并对不相符病例产生的原因进行了阐述。2007年美国临床肿瘤学会(ASCO)发布HER2基因作为乳腺癌治疗指标的更新建议，其中指出，对每一例原发浸润性乳腺癌的诊断，以及复发病人选择曲妥珠单抗治疗前都应进行 HER2 基因表达水平的评估检测(Harris L, Fritsche H，Mennel R, et al. AmericanSociety of Clinical Oncology 2007 Update of Recommendations for the Use ofTumor Markers in Breast Cancer[J]. J Clin Oncol, 2007, 25 (33) :5287-5312)。乳腺肿瘤患者ffiR2阳性意味着乳腺肿瘤细胞表面的HER2蛋白数量增多，过度传递信号，刺激癌细胞疯狂增殖，HER2阳性的患者同其他乳腺癌病人相比，肿瘤恶性程度更高，进展更快，更容易复发和远处转移，且此类病人通常对内分泌治疗(他莫昔芬)不敏感，预后较差(Salvadori B，Pinzani P, Distante V, et al. Comparison of Pre-and Post SurgicalConcentrations of Blood HER-2 mRNA and HER-2Extracellular Domain Reflects HER-2Status in Early Breast Cancer [J]. Clin Chem, 2005，51 (I) : 254-256)。1998 年被美国FDA批准上市，2002年在中国上市的生物靶向治疗药物曲妥珠单抗(Trastuzumab )商品名赫赛汀(Here印tin)，是人类历史上第一个生物基因靶向治疗药物，作为癌症治疗史上的重要突破，赫赛汀的出现将乳腺癌的治疗引入了生物基因靶向治疗的新时代。赫赛汀(曲妥珠单抗)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于HER2的细胞外部位，该药能够靶向作用于HER2受体，主要用于HER2过表达的乳腺癌患者，研究报道指出，HER2阳性的乳癌患者在化疗时加用曲妥珠单抗，可降低乳腺癌患者的复发风险和病死率，延长患者的生存期(Slamon D, Eiermann ff, Robert N，et al. Adjuvant Trastuzumab inHER2-Positive Breast Cancer [J], N Engl J Med, 2011，365:1273-1283)。目前医学界已经达成共识，曲妥珠单抗是HER2阳性乳腺癌的一种有效治疗手段(Shak S. Overview ofthe Trastuzumab(Herceptin)Anti-HER2 Monoclonal Antibody Clinical Program inHER2-overexpressing Metastatic Breast Cancer[J]. Semin Oncol, 1999，26(4):71-77)。因此，准确的HER2检测对于乳腺癌靶向治疗患者的筛选起决定性作用。目前，FDA认可的筛选HER2基因扩增的乳腺癌患者的方法有免疫组织化学(IHC)法和突光原位杂交(Fluorescence in Situ Hybridization, FISH)法,一般采用免疫组织化学法检测HER2受体蛋白过度表达，应用荧光原位杂交法检测HER2基因的扩增水平(Kroese M, Zimmern RL, Pinder SE. HER2 Status in Breast Cancer-an Example ofPharmacogenetic Testing[J]. J R Soc Med. 2007,100:326-329)。免疫组织化学法检测HER2蛋白表达是目前最为常用的方法，它是用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术，IHC法因其操作简便、价格低廉、判读方便、便于保存等优点，已广泛应用于临床病理诊断，但由于其检测过程缺乏标准化，且结果易受组织处理、不同抗体的敏感性差异、观察者主观判断的不同以及17号染色体多体的干扰的影响，常造成其检测结果的差异。
比较而言，荧光原位杂交法通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，利用荧光检测体系对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析，其检测冷冻组织或福尔马林固定、石蜡包埋组织的J1ER2基因扩增的稳定性较好，不易受组织处理等影响，且应用不同颜色的荧光信号同时标记J1ER2基因和17号染色体着丝粒，消除了 17号染色体多体的干扰，然而FISH也存在检测费用昂贵、荧光淬灭致结果无法长期保存、操作难度大，时间长、并且不利于病理医生在暗视野下观察组织细胞形态等缺点，从而导致HER2假阳性或假阴性的误判等缺陷。继而发展的实时荧光定量PCR是一种体外扩增特异DNA片段，能在短时间内获得数百万个特异产物的技术，并能实时监控，闭管检测，具有快速简便、灵敏度高和无交叉污染等优点。依据其原理发明的实时定量RT-PCR，已被认为是定量检测mRNA的金标准方法。本发明以专利技术一环状引物(阮力，何东华，郑立谋，陈琰.一种用于核酸扩增的环形引物及其应用.中国专利CN 101671674A)为引物，建立一种应用于HER 2 mRNA定量检测的方法。环状引物由于存在的自身反向互补双链结构，只有当靶序列与引物靶序列结合区的结合力大于反向互补双链结合的能量，引物才可以与靶序列发生杂交，并获得扩增产物。因此环状引物较之普通的直线引物具有一定的技术方法优势。
发明内容
本发明的目的提供一种检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明的另一目的在于提供一种既快速、准确，又经济、价廉，并且易于标准化的HER2基因表达水平的检测方法。所述检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒包括HER2基因PCR反应液、ACTB基因PCR反应液、Taq酶系、对照品和包装物；所述HER2基因PCR反应液由PCR反应缓冲液、HER2基因特异性上游引物、HER2基因特异性下游引物和EVA Green荧光染料组成，所述ACTB基因PCR反应液由PCR反应缓冲液、ACTB基因特异性上游引物、ACTB基因特异性下游引物和EVA Green荧光染料组成；所述HER2基因特异性上游引物F序列为5’ -GTCCGTCCTACAACTACCTTTCTACGGAC-3 ；
所述HER2基因特异性下游引物R序列为5， -TGAGAAGGGCTTGCTGCACTTCTCA-3，；所述ACTB基因特异性上游引物F序列为5， -CAGGATTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3，；所述ACTB基因特异性下游引物R序列为5， -CGCCAACAGACAGC ACTGTGTTGGCG-3 ；其中，引物5’端和3’端带有下划线的碱基为参与形成引物内双链结合区的碱基。所述PCR 反应缓冲液由 IOOmM Tris-HCL (pH8. 8)、50mM KCLUOmM MgSO4,50mM (NH4) 2S04 和 25mM dNTPs 组成。所述HER2基因特异性上游弓丨物的浓度、HER2基因特异性下游弓丨物的浓度、ACTB基因特异性上游引物的浓度和ACTB基因特异性下游引物的浓度可均为50 u M0所述Taq酶系可采用热启动Taq酶，每反应用量可为1U。所述对照品可采用MCF-7细胞株cDNA和无模板对照品(NTC)等。所述包装物可采用瓶或管等。当所述检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒进行待测样本检测时，只有当对照品J1ER2基因和ACTB基因检测呈阳性，无模板对照品HER2基因和ACTB基因检测无信号时，待检测样本的检测结果才有效。PCR的扩增程序为第一阶段95°C 5min I个循环；第二阶段95°C 10s,63°C15s，72°C 15s，5个循环；第三阶段95°C 10s，60°C 15s，72°C 15s，35个循环；信号收集第二阶段72°C时收集FAM。其中第二阶段用于富集特异产物，第三阶段用于扩增。本发明的优点是(1)设计了 5’端修饰了的HER2基因和ACTB内参基因引物，避免了引物二聚体的形成；(2)运用染料法实时荧光定量RT-PCR的检测方法，大大降低了试剂盒的成本，减轻了病患的经济负担；(3)检测速度快，整个检测过程只需要90min。
图I为显示5’端修饰的特异性引物的PCR扩增原理。图2为HER2基因103、104、105、IO6Copise/ii L的4个标准品模板的标准曲线图。在图2中，横坐标为浓度的对数Log copies/UL，纵坐标为扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Ct值(dRn) ；y=3. 410x+29. 79 R2=O. 998，-Eff = 96. 5%。图3为ACTB基因103、104、105、IO6Copise/ii L的4个标准品模板的标准曲线图。在图3中，横坐标为浓度的对数Log copies/UL，纵坐标为扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Ct值(dRn) ；y=3. 468x+31. 40R2=0. 995，-Eff = 94. 2%。图4为显示PCR扩增的反应程序。在图4中，纵坐标为温度Temperature (V)。图5为无模板对照品中HER2基因(三角形曲线)和ACTB基因(平滑曲线)的扩增曲线图。在图5中，横坐标PCR循环数Cycles，纵坐标为扩增反应的荧光值Fluorescence (dRn);曲线 a 为 HER2,曲线 b 为 ACTB。图6为对照品中HER2基因(三角形曲线)和ACTB基因(平滑曲线)的扩增曲线图。在图6中，横坐标PCR循环数Cycles,纵坐标为扩增反应的突光值Fluorescence (dRn);曲线a为HER2，曲线b为ACTB。
由图5和6可见，无扩增信号，处于基线，说明体系没有受到污染；对照品的HER2基因(三角形曲线)和ACTB基因(平滑曲线)扩增曲线，曲线呈S型，说明体系可有效地检测HER2基因的扩增。图7为阴性样本IIHC鉴定为HER2基因表达阴性的样本扩增曲线图。在图7中，横坐标PCR循环数Cycles，纵坐标为扩增反应的荧光值Fluorescence (dRn);曲线a为HER2，曲线b为ACTB0图8为阴性样本2IHC鉴定为HER2基因表达阴性的样本扩增曲线图。在图8中，横坐标PCR循环数Cycles，纵坐标为扩增反应的荧光值Fluorescence (dRn);曲线a为HER2，曲线b为ACTB0图9为阴性样本3IHC鉴定为HER2基因表达阴性的样本扩增曲线图 。在图9中，横坐标PCR循环数Cycles，纵坐标为扩增反应的荧光值Fluorescence (dRn);曲线a为HER2，曲线b为ACTB。图10为阴性样本4IHC鉴定为HER2基因表达阴性的样本扩增曲线图。在图10中，横坐标PCR循环数Cycles,纵坐标为扩增反应的突光值Fluorescence (dRn)；曲线a为HER2,曲线 b 为 ACTB0图11为阳性样本IIHC鉴定为HER2基因表达阳性的样本扩增曲线图。在图11中，横坐标PCR循环数Cycles,纵坐标为扩增反应的突光值Fluorescence (dRn)；曲线a为HER2,曲线 b 为 ACTB0图12为阳性样本2IHC鉴定为HER2基因表达阳性的样本扩增曲线图。在图12中，横坐标PCR循环数Cycles,纵坐标为扩增反应的突光值Fluorescence (dRn)；曲线a为HER2,曲线 b 为 ACTB0图13为阳性样本3IHC鉴定为HER2基因表达阳性的样本扩增曲线图。在图13中，横坐标PCR循环数Cycles,纵坐标为扩增反应的突光值Fluorescence (dRn);曲线a为HER2,曲线 b 为 ACTB0图14为阳性样本4IHC鉴定为HER2基因表达阳性的样本扩增曲线图。在图14中，横坐标PCR循环数Cycles,纵坐标为扩增反应的突光值Fluorescence (dRn)；曲线a为HER2,曲线 b 为 ACTB0在图11 14中，扩增曲线呈S型，定量后F分别为3. 03、5. 93、2. 34、4. 50，说明4例阳性样本中HER2基因基因存在扩增。图15为显示5例经过IHC鉴定为HER2基因表达阳性的样本应用HER2基因表达水平检测试剂盒检测的扩增曲线。图16为显示5例经过IHC鉴定为HER2基因表达阳性的样本应用北京索奥生物医药科技有限公司人Her2/neU基因(Her2)核酸检测试剂盒检测的扩增曲线。在图15和16中，横坐标PCR循环数Cycles，纵坐标为扩增反应的荧光值Fluorescence (dRn);扩增曲线呈S型，说明体系均可有效地检测HER2基因的表达，且检测Ct 值分别为 18. 52,19. 69,20. 81,20. 82,21. 13 和 18. 54,19. 53,20. 65,20. 79,21. 08，说明本试剂盒检测HER2基因表达水平的专一性良好。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明，而不是限制本发明。本发明在对Genebank中已知的人类HER2基因、ACTB基因的基因组序列和mRNA序列进行比对分析，选择HER2基因、ACTB基因的特异性保守区域设计了特异性引物，并在引物的5’端自行设计了 3 8个可以与3’端互补配对碱基修饰，使得一般情况下引物呈环状而非普通的线性，只有在高温变性时引物才会打开与靶序列特异性结合，从而避免了引物二聚体形成(图I)。这些引物在热启动Taq聚合酶、高纯度的脱氧核苷酸(dNTPs)、EVAGreen荧光染料以及Mg2+离子等的PCR反应液中，通过荧光PCR扩增仪实现核酸扩增，根据2_AAGt值法计算HER2基因的表达差异，从而达到快速快速、准确、经济、价廉的检测HER2基因表达水平。所述检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒在扩增待检样本时，需同时检测对照品(MCF-7细胞株cDNA)和无模板对照品(NTC)，通过计算2_AAct值对待检样本和对照品的HER2基因和ACTB基因表达进行定量，然后通过公式A Ct (待检样本)=待检样本HER2基因Ct一待检样本ACTB基因Ct，A Ct (对照品)=对照品HER2基因Ct一对照品ACTB基因Ct，A A Ct= A Ct (待检样本)一 A Ct (对照品)，目的基因的相对总量为2_AAet。 使用2_AA ct定量需要HER2基因和ACTB基因的扩增效率一致，取103、104、105、IO6Copise/y L的4个10倍梯度稀释的标准品，分别检测HER2基因和ACTB基因的Ct值，两个基因的标准曲线斜率小于0. I具有可比性，可用2_AAet (图2和3)。F=2-Act(待■本对照品\ I < 2，表示乳腺癌组织中HER2基因无过表达；2刍F< 4，表示乳腺癌组织中HER2基因有过表达；F ^ 4，表示乳腺癌组织中HER2基因存在明显过表达。实施例1HER2基因表达水平检测试剂盒及其使用I制备包括下列组成成分的试剂盒HER2基因PCR反应液(1200 U L)1管、ACTB基因PCR反应液(1200 ii L) I管、Taq酶系(30ii L) I管、对照品(300 ii L) I管。2样本的采集、保存和运输2. I使用样本类型新鲜组织、冷冻组织。2. 2样本采集手术后将肿瘤组织立即放入液氮冷冻并保存于_80°C。2. 3样本的保存和运输新鲜组织、冷冻组织保存在_80°C，保存期为2年。样本长途运送采用干冰。3、核酸抽提建议使用Invitrogen Trizol RNA提取试剂盒。按照说明书进行操作，最后用30 u L DEPC水溶解，之后立即进行逆转录。4、逆转录建议使用QIAGEN QuantiTect Reverse Transcription 试剂盒。按照说明书进行操作。5、实时荧光定量PCR检测5. I试剂准备按比例吸取相应量的HER2基因PCR反应液、ACTB基因PCR反应液、Taq酶系(HER2基因PCR反应液和ACTB基因PCR反应液各19. 8 ii L/人份+Taq酶系0. 2 ii L/人份)，充分混匀后按20 u L/人份分装入PCR反应管，备用。5. 2加样分别向HER2基因PCR反应管和对应的ACTB基因PCR反应管加入5 ii L逆转录后的cDNA样本，同时向HER2基因PCR反应管和对应的ACTB基因PCR反应管加入5uL对照品样本作为对照品，向HER2基因PCR反应管和对应的ACTB基因PCR反应管加入
5UL双蒸水作为NTC。5. 3 编辑(Stratagene Mx3005P)打开EVA Green荧光染料实验类型，在Plate Setup窗口根据样本放入位置在窗口中选择相应的样本孔并对定义其内容，选择需要采集的信号类型(EVA Green选择FAM)，在Thermal Profile Setup窗口编辑反应程序第一阶段95°C 5min I个循环；第二阶段950C 10s，63°C 15s，72°C 15s，5 个循环；第三阶段 95°C 10s,60°C 15s，72°C 15s，35 个循环；信号收集第三阶段72°C时收集FAM (图4)。所有设置完成后保存文件，运行。5. 4结果分析反应结束后打开Analysis窗口，选择样本孔,点击Results自动分析结果。实施例2应用HER2基因表达水平检测试剂盒检测8例临床样本选取4例经过IHC鉴定为HER2基因表达阴性，4例经过IHC检测为HER2基因表达阳性乳腺癌组织样本，提取RNA后立即逆转录，将得到的逆转录产物进行检测，同时检测对照品、NTC。检测结果解释HER2基因(三角形曲线)和ACTB基因(平滑曲线)的无模板对照品无扩增信号，处于基线，说明体系没有受到污染；对照品J1ER2基因(三角形曲线)和ACTB基因(平滑曲线)曲线呈S型，说明体系可有效地检测HER2基因的表达(图5和6)。4例经过IHC鉴定为HER2基因表达阴性的样本扩增曲线呈S型，定量后F值分别为I. 50、I. 23、I. 75、I. 09，说明4例阴性样本中HER2基因无过表达(图7 10)。4例经过IHC检测为HER2基因表达阳性的样本扩增曲线呈S型，定量后F值分别为3. 03,5. 93,2. 34、
4.50，说明4例阳性样本中HER2基因基因存在过表达(图11 14)。本次实验中8例样本的检测结果与IHC的检测结果完全吻合，说明利用本试剂盒来检测乳腺癌患者中J1ER2基因表达水平是可行的，本试剂盒快速、准确、经济、价廉为临床检验带来便利的同时也能有效地减低病患的经济负担。实施例3应用HER2基因表达水平检测试剂盒与北京索奥生物医药科技有限公司人Her2/neu基因(Her2)核酸检测试剂盒同时检测5例临床样本选取5例经过IHC鉴定为HER2基因表达阳性乳腺癌组织样本，提取RNA后立即逆转录，将得到的逆转录产物进行检测。检测结果解释两试剂盒的HER2基因扩增曲线呈均S型，说明体系均可有效地检测HER2基因的表达，且应用HER2基因表达水平检测试剂盒应用HER2基因(三角形曲线)的Ct值分别为18. 52、19. 69,20. 81,20. 82,21. 13，应用北京索奥生物医药科技有限公司人Her2/neu基因(Her2)核酸检测试剂盒应用HER2基因(平滑曲线)的Ct值分别为18. 54、19. 53,20. 65,20. 79,21.08 (图15和16)，说明本试剂盒检测HER2基因表达水平的专一性良好。
权利要求
1.检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括HER2基因PCR反应液、ACTB基因PCR反应液、Taq酶系、对照品和包装物； 所述HER2基因PCR反应液由PCR反应缓冲液、HER2基因特异性上游引物、HER2基因特异性下游引物和EVA Green荧光染料组成； 所述ACTB基因PCR反应液由PCR反应缓冲液、ACTB基因特异性上游引物、ACTB基因特异性下游引物和EVA Green荧光染料组成； 所述HER2基因特异性上游引物F序列为5’ -GTCCGTCCTACAACTACCTTTCTACGGAC-3 ； 所述HER2基因特异性下游引物R序列为5， -TGAGAAGGGCTTGCTGCACTTCTCA-3，； 所述ACTB基因特异性上游引物F序列为5， -CAGGATTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3，； 所述ACTB基因特异性下游引物R序列为5， -CGCCAACAGACAGC ACTGTGTTGGCG-3 ； 其中，引物5’端和3’端带有下划线的碱基为参与形成引物内双链结合区的碱基；所述 PCR 反应缓冲液由 IOOmM Tris-HCL、50mM KCLUOmM MgS04、50mM(NH4)2S04 和 25mMdNTPs组成。
2.如权利要求I所述的检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述HER2基因特异性上游引物的浓度、HER2基因特异性下游引物的浓度、ACTB基因特异性上游引物的浓度和ACTB基因特异性下游引物的浓度均为50 u M0
3.如权利要求I所述的检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述Taq酶系采用热启动Taq酶，每反应用量为IU。
4.如权利要求I所述的检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述对照品采用MCF-7细胞株cDNA和无模板对照品。
5.如权利要求I所述的检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述包装物采用瓶或管。
全文摘要
检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒，涉及一种PCR试剂盒。所述检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒包括HER2基因PCR反应液、ACTB基因PCR反应液、Taq酶系、对照品和包装物；采用的引物为环状引物，在5’端存在3-8个自行设计的碱基，在合适条件下可以和3’端序列相互结合为双链，可有效地避免了非特异扩增产物尤其是引物二聚体形成，并增加其专一性。利用相对定量实时RT-PCR的方法来检测乳腺癌患者中HER2基因表达水平，采用2-△△Ct值法对检测结果进行定量，可用于乳腺癌的早期及转移的诊断，辅助临床用药的选择和预后判断等多个领域。
文档编号G01N21/64GK102719547SQ201210227940
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者张换敬, 曾骥孟, 李怡, 郑立谋 申请人:厦门大学