专利名称：一种超分辨显微方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明属于超分辨领域，尤其涉及一种能在远场实现超衍射极限的分辨率的超分辨显微方法和装置。
背景技术：
由于光学系统衍射的影响，常规远场光学显微方法可实现的分辨率存在限制。根据阿贝衍射极限理论，光束经显微物镜聚焦后所成光斑的尺寸用半高全宽表示为
Δτ = ▲，其中λ为显微镜的工作波长，NA为所用显微物镜的数值孔径。因此，常规远场 2\ I
光学显fi镜的极限分辨率一般被限制在了半波长左右。近年来，为了突破光学衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，科研工作者们提出了多种超分辨光学显微方法。例如受激发射损耗显微术(STED!Stimulated Emission DepletionMicroscopy)，即利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系，并通过限制受激辐射衰减的区域，减少荧光光斑大小，获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率，从而突破远场光学显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像；结构光照明荧光显微术(SIM !Structured Illumination Microscopy);随机光场重建显微术(STORM StochasticOptical Reconstruction Microscopy)等。上述几种方法均可以在远场实现荧光超分辨显微，在实际测试中也得到了相应的应用，但是都还仍然存在着不足。其中，STED显微术的分辨率由所加损耗光的光功率决定，因此当实现高分辨率时，其所要求的光功率很强，容易导致荧光分子的漂白。此外，STED显微术的系统较为复杂，造价一般比较昂贵。SIM显微术对光功率的要求虽然不高，但是由于其需要光栅扫描，成像速度较慢，成像系统也较为复杂。STORM显微术的成像速度也很慢，目前还很难运用于活体细胞的实时检测当中。
发明内容
本发明提供了一种超分辨显微方法和装置，可以在远场实现超衍射极限的分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、分辨率高等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。一种超分辨显微方法，包括以下步骤I)将激光器发出的激光光束准直后转换为线偏振光；2)对所述线偏振光进行相位调制，调制函数为/JA勿=0，其中，P为光束上某点与光轴的距离，炉为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角；3)将所述相位调制后的线偏振光进行光路偏转；4)偏转后的光束经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，以实现对待测样品的二维扫描；
5)在二维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I1U, y)，其中X，y为扫描点的二维坐标；6)将步骤2)中的调制函数切换为.Z2(ZVZj) =炉，P为光束上某点与光轴的距离，炉
为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角；7)重复步骤3)和步骤4)，对步骤5)中的各扫描点进行第二次扫描，收集得到的第二信号光强U，y)；8)根据公式I (x,y) = I1 (x,y)- Y I2(x,y)计算有效信号光强I (x，y)，并利用I (x，
^max
y)得到超分辨图像，其中第一信号光强I1(^y)中的最大值j■为第二信 号光强I2(x，y)中的最大值。当待测样品为荧光样品时，所述信号光为所述圆偏振光经显微物镜投射后在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为所述圆偏振光经显微物镜投射后经样品表面的反射光束。待测样品上的X，y轴方向由二维扫描方向决定。所述有效信号光强值I (X，y)为负时,设置I(x, y) =0。本发明提供了一种超分辨显微装置，包括光源、承载待测样品的样品台和将光线投射到所述样品台的显微物镜，所述光源与显微物镜之间依次设有用于将所述光源发出的光束改变为线偏振光的起偏器；用于对所述线偏振光进行相位调制的空间光调制器；用于对所述相位调制后的光束进行光路偏转的扫描振镜系统；依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光束进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上；并设有用于控制所述空间光调制器和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。探测系统包括布置在空间光调制器和扫描振镜系统之间的分束镜，所述分束镜在待测样品为荧光样品时应选用二色镜，当待测样品为非突光样品时应选用偏振分光棱镜；用于滤去分束镜出射的信号光中的杂散光的带通滤波片，所述带通滤波片在待测样品为非突光样品时可以省略；用于探测信号光束的光强信号的探测器，所述探测器选用光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)；用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾
里斑直径。所述光源与起偏器之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波和准直的单模光纤和准直透镜。
所述空间光调制器具有可切换的第一调制函数/(p,灼=0和第二调制函数/2(/ ，供)=免，其中，P为光束上某点与光轴的距离,炉为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角。空间光调制器中两函数的切换频率与扫描振镜系统的帧扫描频率相同，从而实现扫描振镜系统每扫描一巾贞图像，空间光调制器的调制函数切换一次。优选的，所述显微物镜的数值孔径NA = I. 4。本发明还提供了一种超分辨显微装置，包括第一光源、第二光源、承载待测样品的样品台和将光线投射到所述样品台的显微物镜，还包括位于第一光路上的第一起偏器；
沿第二光路依次布置的第二起偏器和位相板；用于将所述第一光路和第二光路上的光线进行偏转的扫描振镜系统；依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光线进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上；并设有控制所述第一光源、第二光源和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。探测系统包括布置在空间光调制器和扫描振镜系统之间的分束镜，所述分束镜在待测样品为荧光样品时应选用二色镜，当待测样品为非突光样品时应选用偏振分光棱镜；用于滤去分束镜出射的信号光中的杂散光的带通滤波片，所述带通滤波片在待测样品为非突光样品时可以省略；用于探测信号光束的光强信号的探测器，所述探测器选用光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)；用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾
里斑直径。所述第一光源与第一起偏器之间依次设有第一单模光纤和第一准直透镜，所述第二光源和第二起偏器之间依次设有第二单模光纤和第二准直透镜。所述位相板的调制函数为./;(A灼=0，其中，P为光束上某点与光轴的距离，炉为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角。优选的，所述显微物镜的数值孔径NA = I. 4。本发明原理如下由于光学系统衍射的影响，平行入射的照明光束经显微物镜聚焦之后，在待测样品上所成的光斑并非一个理想的点，而是一个具有一定尺寸的衍射斑。在衍射斑照射范围内的样品均会发出相应的信号光，从而使得这一范围内样品的细节无法被分辨，由此限制了显微系统的分辨率。因此，要突破光学衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，如何减小在扫描点处有效信号光的发光面积便成为了关键。
在本发明方法中，当空间光调制器的调制函数为/(P,炉)=0时，由德拜积分计算可得，调制后光束经显微物镜聚焦后在样品上所成光斑为一个实心光斑。该实心光斑的尺寸与常规光学显微术中所用照明光束聚焦所成衍射斑的尺寸相同。该实心光斑照射范围内的样品所发出的信号光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第一信号光强I1 ;当空间光调制器的调制函数为/:(P，灼=炉时，由德拜积分计算可得，调制后光束经显微物镜聚焦后在样品上所成光斑为一个面包圈型的空心光斑。该空心光斑照射范围内的样品所发出的信号光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第二信号光强12。利用公式I (X，y) = I1U,y)-yl2 (X，y)计算得到I (X，y)，显然I (x，y)所对应的各扫描点处的有效信号光发光面积将小于I1U, y)所对应的各扫描点处的第一信号光发光面积。因此，与常规光学显微方法相比，本发明减小了有效信号光的发光面积，从而可以实现超衍射极限的分辨率。相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果(I)可以在较低的光功率条件下实现超衍射极限的分辨率；
(2)成像速度快，在每一帧图像的扫描点数为512X512的情况下，帧频可达到每秒15帧以上；(3)装置简单，操作方便。
图I为本发明一种超分辨显微装置的示意图。图2为本发明中所成实心光斑的归一化光强分布曲线。图3为本发明中所成面包圈型空心光斑的归一化光强分布曲线。图4为本发明中有效信号光光斑与常规光学显微术中信号光光斑的归一化光强分布比较曲线。图5为本发明与常规光学显微方法对同一样品扫描所得图像中的光强分布比较曲线。图6为采用两个激光器实现本发明方法的装置示意图。
具体实施例方式下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。如图I所示，一种超分辨显微装置，包括激光器1，单模光纤2，准直透镜3，起偏器4、空间光调制器5,分束镜6,扫描振镜系统7,扫描透镜8,场镜9,1/4波片10,显微物镜11，样品台12，带通滤波片13，聚焦透镜14，针孔15，探测器16，控制器17。其中，单模光纤2、准直透镜3、起偏器4、空间光调制器5依次位于激光器I出射光束的光轴之上；所述起偏器4的透光轴与水平方向平行。其中，分束镜6、扫描振镜系统7依次位于经空间光调制器5调制后光束的光轴之上。其中，扫描透镜8、场镜9、1/4波片10、显微物镜11、样品台12依次位于扫描振镜系统7出射光束的光轴之上；所述样品台12位于显微物镜11的焦平面附近。其中，带通滤波片13，聚焦透镜14，针孔15，探测器16依次位于分束镜6反射光束的光轴之上；所述针孔15位于聚焦透镜14的焦平面处。
其中，控制器17分别与空间光调制器5以及扫描振镜系统7相连，用于控制空间光调制器5的切换以及扫描振镜系统7的扫描；所述空间光调制器5在控制器17的控制下按照一定的切换频率在以下两种调制函数之间切换二 0和_/^(/7，約=炉，其中，P为光束上某点与光轴的距离，炉为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角；所述空间光调制器5的切换频率与扫描振镜系统7的巾贞扫描频率相同，从而实现扫描振镜系统7每扫描一帧图像，空间光调制器5的调制函数切换一次。上述装置中，显微物镜11的数值孔径NA = I. 4 ;所用针孔15的直径为O. 73个艾里斑直径，探测器16为雪崩光电二极管(APD)。采用图I所示的装置进行超分辨显微的方法如下从激光器I发出的激光光束，首先被导入单模光纤2，从单模光纤2出射的激光光束，经过准直透镜3完成准直。经过准直后的光束入射到起偏器4转换为线偏振光，之后入射到空间光调制器5上进行相位调制。利用控制器17对空间光调制器5进行控制，使相位调制函数切换为
权利要求
1.一种超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将激光器发出的激光光束准直后转换为线偏振光； 2)对所述线偏振光进行相位调制，调制函数为/(A約=O，其中，P为光束上某点与光轴的距离4为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角； 3)将所述相位调制后的线偏振光进行光路偏转； 4)偏转后的光束经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，以实现对待测样品的二维扫描； 5)在二维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I1U, y)，其中X，y为扫描点的二维坐标； 6)将步骤2)中的调制函数切换为Λ(Α0)= Ρ，P为光束上某点与光轴的距离，炉为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角； 7)重复步骤3)和步骤4)，对步骤5)中的各扫描点进行第二次扫描，收集得到的第二信号光强I2(x，y)； 8)根据公式I(x,y)= I1 (x, y)- Y I2 (x, y)计算有效信号光强I(x，y)，并利用I(x，y) 得到超分辨图像，其中
2.如权利要求I所述的超分辨显微方法，其特征在于，所述有效信号光强值I(x，y)为负时，设置I (X，y) =0。
3.一种超分辨显微装置，包括光源、承载待测样品的样品台和将光线投射到所述样品台的显微物镜，其特征在于，所述光源与显微物镜之间依次设有 用于将所述光源发出的光束改变为线偏振光的起偏器； 用于对所述线偏振光进行相位调制的空间光调制器； 用于对所述相位调制后的光束进行光路偏转的扫描振镜系统； 依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光束进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜； 用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上； 并设有用于控制所述空间光调制器和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。
4.如权利要求3所述的超分辨显微装置，其特征在于，所述光源与起偏器之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波和准直的单模光纤和准直透镜。
5.如权利要求3所述的超分辨显微装置，其特征在于，所述空间光调制器具有可切换的第一调制函数/(P,炉)=O和第二调制函数/2(A炉)=炉，其中，P为光束上某点与光轴的距离，口为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角。
6.如权利要求3所示的超分辨显微装置，其特征在于，所述显微物镜的数值孔径NA=I. 4。
7.一种超分辨显微装置，包括第一光源、第二光源、承载待测样品的样品台和将光线投射到所述样品台的显微物镜，其特征在于，还包括位于第一光路上的第一起偏器； 沿第二光路依次布置的第二起偏器和位相板； 用于将所述第一光路和第二光路上的光线进行偏转的扫描振镜系统； 依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光线进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜； 用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上； 并设有控制所述第一光源、第二光源和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。
8.如权利要求7所述的超分辨显微装置，其特征在于，所述第一光源与第一起偏器之 间依次设有第一单模光纤和第一准直透镜，所述第二光源与第二起偏器之间依次设有第二单模光纤和第二准直透镜。
9.如权利要求7所述的超分辨显微装置，其特征在于，所述位相板的调制函数为Λ(Α供)=供，其中，P为光束上某点与光轴的距离，炉为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角。
10.如权利要求7所述的超分辨显微装置，其特征在于，所述显微物镜的数值孔径NA=I.4。
全文摘要
本发明公开了一种超分辨显微方法和装置，其中方法包括将激光器发出的激光光束准直后转换为线偏振光；线偏振光经第一次相位调制后进行光路偏转；偏转后的光束经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，收集待测样品各扫描点发出的信号光，得到第一信号光强；切换调制函数，对线偏振光进行第二次相位调制后投射到待测样品上，收集待测样品各扫描点发出的信号光，得到第二信号光强；计算有效信号光强，并得到超分辨图像。本发明装置简单，操作方便；可以在较低的光功率条件下实现超衍射极限的分辨率；成像速度快，在每一帧图像的扫描点数为512×512的情况下，帧频可达到每秒15帧以上。
文档编号G01N21/64GK102735617SQ201210227898
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者刘旭, 匡翠方, 李帅, 郝翔, 顾兆泰 申请人:浙江大学