荧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明是关于生物质能利用技术，特别设及巧光显微筛检生长快和油脂高的微藻 单细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 微藻对太阳能利用效率高、生长繁殖迅速、对环境的适应能力强、油脂产量高。据 报道微藻的光合作用转化效率理论值可达10%，在单位面积上每年油脂产量可达栋桐油产 量的8?24倍化U et al.，2008)。化isti (化isti，2007)建立数学模型计算得到微藻生 物柴油是取代石化油的重要选择，化eng等人发现核福射诱变可W显著提高小球藻的生长 速率和生物质密度烟leng et al.,2013a)。化ozin等人综述了缺氮条件下娃藻油脂合成 中基因的表达情况化 hozin-Goldberg and Cohen, 2011)，Mock 等人（Mock et al., 2008) 发现在缺娃条件下娃藻化alassiosira pseudonana有75对基因诱导。但是微藻生长速 率与其富集油脂之间存在相互矛盾，当绝大多数微藻达到最高的生长速率时，其细胞中油 脂含量往往比较低；而人为控制细胞生长的宏观条件（温度、光照、pH、氮源、碳源等）使微 藻细胞内油脂含量增加时，其细胞的生长速率W及微藻对于太阳能的转化效率则会明显降 低。国外一些主要的研发机构都将高产油藻株的种质创新列为整个微藻产油系统工程中的 首要位置，故如何获得生长速率快、油脂含量高的优势藻种是关键问题。
[0003] 传统测量微藻生长速率的方法是将藻细胞接种后扩大培养数日，然后过滤脱水和 烘干测量单位体积藻液中的生物质密度。但是该方法费时费力成本较高，尤其是对于大量 筛检核诱变后的成千上万个藻种突变体时，往往因工作量过于庞大而难W完成全部筛检任 务。例如将菱形藻液（含有藻细胞约6. 7X 1〇5个/mL)在lOOGy的丫射线下进行核福射 诱变，由于藻细胞致死率约为60 %，故至少会产生2. 7 X 105个/mL突变单细胞活体。利用 巧光显微镜自动移位对焦的电子控制载物台新技术、W及配套的CCD相机在白光条件下对 大量藻细胞进行自动扫描拍摄，通过辨别藻细胞颜色进行定量化数据分析则有希望高速筛 选出生长速率快的藻细胞，而目前关于该方面的研究报道还比较少。
[0004] 巧罗红染色利用巧光定量检测细胞内油脂含量由Greenspan最早提出 (Greenspan et al. , 1985)，此方法的准确性已在多种生物中被证实（Genicot et al.，2005出uang et al.，2009)，可代替传统的称重法对细胞内油脂含量进行监测。由于巧 罗红在水中很快发生巧光泽灭，多余的染料无需清除，与苏丹黑、巧罗藍-A等染料比较，巧 罗红能够准确地将细胞内脂类物质与其他贬藏物区分开来（Kranz et al.，1997)，经常被 用于检测动物W及微生物细胞内油脂情况。故利用巧罗红与油脂成分结合后在巧光显微镜 下发出巧光的特性，建立一套利用巧光显微测量藻细胞生长过程中的油脂含量，是一种快 速筛检高产油藻种的高效可行方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种巧光显微筛检生长快和 油脂高的微藻单细胞的方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：
[0006] 提供巧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法，具体包括下述步骤：
[0007] (1)取5 y L微藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，将藻细胞取出接种 到20mL培养基，放入=角瓶扩大培养，获得许多株单细胞藻液；
[000引 似用96孔板接种300化单细胞藻液，初始接种抑调至8?9,在恒温20?30°C、 光照强度5000?70001UX、光照2化条件下培养至稳定期；将96孔板置于巧光显微镜自动 移位对焦的电子控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板中每孔 的藻细胞进行自动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件通过拍摄的显微镜图像对每孔藻细 胞的颜色进行定量化数据分析，筛选出生长速率快（生长速率>0.4g/L，d)的优势微藻单 细胞（由于藻细胞密度越大时颜色越深则表明生长速率越快，从而能够筛选出生长速率快 的优势微藻单细胞）；
[0009] 做用0. Ig/L的巧罗红巧光染料Nile/DMSO对步骤似中筛选得到生长速率快的 微藻单细胞进行染色，巧罗红巧光染料终浓度达到0. Img/l，染色时间7min ;将染色藻细胞 置于巧光显微镜的载物台上，在EX 450-490nm波长下结合图像处理软件观察测量藻细胞 的巧光强度，测量视野中所有藻细胞的面积W及细胞内所有油滴的面积，计算藻细胞的油 脂含量，从而筛选出油脂含量高（油脂含量> 40% )的优势微藻单细胞；
[0010] 油脂含量的计算方法为：
[0011] 油脂含量L'Ca = ^x1(K)%其中Ac为藻细胞的面积总和（ym2)，A历细胞中油脂 颗粒的面积总和（ym2)。
[0012] 本发明中，所述培养基的组分及配比关系为；0. 15g化肥化、0. 02g皿2口〇4、〇. 〇27g VBi、1. 5X 10-6g VBi2、〇.2g Na2SiO3.9H2CKl.Og NaN〇3、0.0005g Biotin、1血微量元素和 980血人工海水。
[001引本发明中，所述微量元素的组分及配比关系为；1000血蒸馈水中含有4. 35g 化2邸TA、7. 3mg Na2Mo04?2H20、12mgCoCl2*6H20、3. 9g 化〔6&07?5&0、10111肖 CuS04?5H20、 23mg ZnS04、178mg MnClg ?轴20 和 600mg H3BO3。
[0014] 本发明中，所述人工海水的组分及配比关系为（盐度=3.0%) :1000血蒸馈水中 含有 21.2157g 化Cl、3. 407g Na2S〇4、0. 3577g KC1、9. 3042g MgCl2.6H2〇、1.3044g CaCls、 0. 0862g 邸r、0. 0226g &8〇3、0. 2760g NaF 和 0. 0219g SrCla ? 6&0。
[0015] 本发明中，所述微藻液体中的藻种是下述任意一种；从自然环境中筛选得到的天 然藻种、物理化学诱变得到的藻种突变体或经过基因改良得到的转基因藻种。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0017] 利用巧光显微镜自动移位对焦的电子控制载物台和巧罗红染色技术，在白光条件 下定量分析藻细胞的颜色数据筛选出生长速率快的藻细胞，然后根据藻细胞及油滴的巧光 强度测量计算出油脂含量，从而能够在10分钟左右对96孔板的藻细胞快速筛检出生长速 率快（>0.4g/L'd)和油脂含量高（>40%)的优势藻株，大大提高了筛选目标藻株的工 作效率，减少了劳动时间成本。
【附图说明】
[001引图1为本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述：
[0020] 如图1所示一种巧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法，具体包括下 述步骤：
[0021] (1)取5 y L微藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，所述微藻液体的藻 种包括从自然环境中筛选得到的天然藻种、物理化学诱变得到的藻种突变体、经过基因改 良得到的转基因藻种。将藻细胞取出接种到20mL培养基，放入S角瓶扩大培养。
[00。] 所述培养基的组分及配比关系为；0. 15g NaHC〇3、0. 02g皿2口〇4、〇. 〇27g VBi、 1.5Xl〇-6g VBi2、0. 2g Na2Si〇3.9H2〇、1.0g NaN〇3、0. 0005g BiotinUmL 微量元素和 980mL 人工海水。所述微量元素组分及配比关系为；1000血蒸馈水中含有4. 35g化2邸TA、7. 3mg NagMoO* ? 2H2〇、12mgCoCl2 ? 6&0、3. 9g 化〔6&〇7 ? 5H2〇、10mg OiS〇4 ? 5H2〇、23mg ZnS〇4、178mg MnCla .A&O和600mg H3BO3。所述人工海水配方（盐度=3. 0% )为；1000血蒸馈水中含有 21.2157g NaCl、3. 407g Na2S〇4、0. 3577g KC1、9. 3042g MgCl2.6H2〇、1.3044g CaCl2、0. 0862g 邸r、0. 0226g &8〇3、0. 2760g NaF 和 0. 0219g SrCla ? 6&0。
[002引 似用96孔板接种300化单细胞藻液，初始接种抑调至8?9,在恒温20?30°C、 光照强度5000?70001UX、光照2化条件下培养至稳定期；将96孔板置于巧光显微镜自动 移位对焦的电子控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板中每孔 的藻细胞进行自动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件对每孔藻细胞的颜色进行定量化数 据分析。由于藻细胞密度越大时颜色越深则表明生长速率越快，从而能够筛选出生长速率 快（> 0. 4g/L ? d)的优势微藻单细胞；
[0024] (3)用0. Ig/L的巧罗红巧光染料Nile/DMSO对筛选得到生长速率快的微藻单细胞 进行染色，巧罗红巧光染料终浓度达到0. Img/l，染色时间7min ;将染色藻细胞置于巧光显 微镜的载物台上，在EX 450-490nm波长下结合图像处理软件观察测量藻细胞的巧光强度， 测量视野中所有藻细胞的面积W及细胞内所有油滴的面积，计算藻细胞的油脂含量，从而 筛选出油脂含量高40% )的优势微藻单细胞；
[0025] 油脂含量的计算方法为：
[0026] 油脂含量= 其中Ac为藻细胞的面积总和（ym 2)，A巧细胞中油脂 C ? 颗粒的面积总和（ym2)。
[0027] 下面的实施例可W使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不W任何方 式限制本发明。
[00測实施例1
[0029] (1)取5 y L菱形藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，将藻细胞取出接 种到20mL培养基，放入S角瓶扩大培养。
[0030] 所述培养基的组成为；0. 15g NaHC〇3、0. 02g 皿2口〇4、〇. 〇27g VBi、l. 5Xl〇-6g VBi2、 0. 2g Na2SiO3.9H2OJ.Og NaN〇3、0. 0005g BiotinU血微量元素和 980血人工海水；所 述微量元素主要成分为；1〇〇〇血蒸馈水中含有4. 35g化2邸TA、7. 3mg Na2Mo〇4.2H2〇、 12mgCoCl2*6H2〇、3. 9g FeCeH5〇7*5H2〇、10mg CuS〇4*5H2〇、23mg ZnS〇4、178mg MnClg.A