&O 和 600mg H3BO3。所述人工海水配方（盐度=3. 0%)为；1000血蒸馈水中含有21.2157g化Cl、 3. 407g Na2S〇4、0. 3577g KC1、9. 3042g MgCla ? 6&0、1. 3044g CaCl2、0. 0862g 邸r、0. 0226g &8〇3、0. 2760g NaF 和 0. 0219g SrCl2 ? 6&0。
[003U 似用96孔板接种300化单细胞藻液，初始接种抑调至8,在恒温20°C、光照强 度50001UX、光照2化条件下培养至稳定期。将96孔板置于巧光显微镜自动移位对焦的电子 控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板中每孔的藻细胞进行自 动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件对每孔藻细胞的颜色进行定量化数据分析。由于藻 细胞密度越大时颜色越深则表明生长速率越快，从而能够筛选出生长速率快（0. 42g/L ? d) 的优势微藻单细胞。
[003引 （3)用巧罗红巧光染料（0. lg/l，Nile/DMSO)对筛选得到生长速率快的微藻单细 胞进行染色（巧罗红终浓度0. Img/l，染色时间7min)，将染色藻细胞置于巧光显微镜的载 物台上，在EX 450-490nm波长下结合图像处理软件观察测量藻细胞的巧光强度，测量视野 中所有藻细胞的面积W及细胞内所有油滴的面积，计算藻细胞的油脂含量，从而筛选出油 脂含量高（47% )的优势微藻单细胞。油脂含量计算方法为：
[003引油脂含量= 其中A。为藻细胞的面积总和（ym2)，A,为细胞中油脂 C ， 颗粒的面积总和（ym2)。
[0034] 实施例2
[0035] (1)取5 y L小球藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，将藻细胞取出接 种到20mL培养基，放入S角瓶扩大培养。
[0036] 所述培养基的组成为；0. 15g NaHC〇3、0. 02g 皿2口〇4、〇. 〇27g VBi、l. 5Xl〇-6g VBi2、 0. 2g Na2SiO3.9H2OJ.Og NaN〇3、0. 0005g BiotinU血微量元素和 980血人工海水；所 述微量元素主要成分为；1〇〇〇血蒸馈水中含有4. 35g化2邸TA、7. 3mg Na2Mo〇4.2H2〇、 12mgCoCl2*6H2〇、3. 9g FeCeH5〇7*5H2〇、10mg CuS〇4*5H2〇、23mg ZnS〇4、178mg MnClg.A&O 和 600mg H3BO3。所述人工海水配方（盐度=3. 0%)为；1000血蒸馈水中含有21.2157g化Cl、 3. 407g Na2S〇4、0. 3577g KC1、9. 3042g MgCla ? 6&0、1. 3044g CaCl2、0. 0862g 邸r、0. 0226g &8〇3、0. 2760g NaF 和 0. 0219g SrCl2 ? 6&0。
[0037] 似用96孔板接种300化单细胞藻液，初始接种抑调至8. 5,在恒温25°C、光照 强度60001UX、光照2化条件下培养至稳定期。将96孔板置于巧光显微镜自动移位对焦的 电子控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板中每孔的藻细胞进 行自动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件对每孔藻细胞的颜色进行定量化数据分析。由 于藻细胞密度越大时颜色越深则表明生长速率越快，从而能够筛选出生长速率快化84g/ L ? d)的优势微藻单细胞。
[0038] (3)用巧罗红巧光染料（0. lg/l，Nile/DMSO)对筛选得到生长速率快的微藻单细 胞进行染色（巧罗红终浓度0. Img/l，染色时间7min)，将染色藻细胞置于巧光显微镜的载 物台上，在EX 450-490nm波长下结合图像处理软件观察测量藻细胞的巧光强度，测量视野 中所有藻细胞的面积W及细胞内所有油滴的面积，计算藻细胞的油脂含量，从而筛选出油 脂含量高（58% )的优势微藻单细胞。油脂含量计算方法为：
[0039] 油脂含量LC* = |^xlCl(m其中Ac为藻细胞的面积总和（ym2)，At为细胞中油脂 ； 靴C ， 颗粒的面积总和（ym2)。
[0040] 实施例3
[0041] (1)取5 y L微拟球藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，将藻细胞取出 接种到20mL培养基，放入=角瓶扩大培养。
[0042] 所述培养基的组成为；0. 15g NaHC〇3、0. 02g 皿2口〇4、〇. 〇27g VBi、l. 5Xl〇-6g VBi2、 0. 2g Na2SiO3.9H2OJ.Og NaN〇3、0. 0005g BiotinU血微量元素和 980血人工海水；所 述微量元素主要成分为；1〇〇〇血蒸馈水中含有4. 35g化2邸TA、7. 3mg Na2Mo〇4.2H2〇、 12mgCoCl2*6H2〇、3. 9g FeCeH5〇7*5H2〇、10mg CuS〇4*5H2〇、23mg ZnS〇4、178mg MnClg.A&O 和 600mg H3BO3。所述人工海水配方（盐度=3. 0%)为；1000血蒸馈水中含有21.2157g化Cl、 3. 407g Na2S〇4、0. 3577g KC1、9. 3042g MgCla ? 6&0、1. 3044g CaCl2、0. 0862g 邸r、0. 0226g &8〇3、0. 2760g NaF 和 0. 0219g SrCl2 ? 6&0。
[00创 似用96孔板接种300化单细胞藻液，初始接种抑调至9,在恒温30°C、光照强 度70001UX、光照2化条件下培养至稳定期。将96孔板置于巧光显微镜自动移位对焦的电子 控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板中每孔的藻细胞进行自 动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件对每孔藻细胞的颜色进行定量化数据分析。由于藻 细胞密度越大时颜色越深则表明生长速率越快，从而能够筛选出生长速率快（0. 56g/L ? d) 的优势微藻单细胞。
[0044] (3)用巧罗红巧光染料（0. lg/l，Nile/DMSO)对筛选得到生长速率快的微藻单细 胞进行染色（巧罗红终浓度0. Img/l，染色时间7min)，将染色藻细胞置于巧光显微镜的载 物台上，在EX 450-490nm波长下结合图像处理软件观察测量藻细胞的巧光强度，测量视野 中所有藻细胞的面积W及细胞内所有油滴的面积，计算藻细胞的油脂含量，从而筛选出油 脂含量高（52% )的优势微藻单细胞。油脂含量计算方法为：
[0045] 油脂含量= 其中Ac为藻细胞的面积总和（ym2)，A历细胞中油脂 C ， 颗粒的面积总和（ym2)。
[0046] 最后，需要注意的是，W上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于 W上实施例，还可W有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 荧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法，其特征在于，具体包括下述步 骤： (1) 取5yL微藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，将藻细胞取出接种到 20mL培养基，放入三角瓶扩大培养，获得许多株单细胞藻液； (2) 用96孔板接种300yL单细胞藻液，初始接种pH调至8?9,在恒温20?30°C、光 照强度5000?70001ux、光照24h条件下培养至稳定期；将96孔板置于焚光显微镜自动移 位对焦的电子控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板中每孔的 藻细胞进行自动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件通过拍摄的显微镜图像对每孔藻细胞 的颜色进行定量化数据分析，筛选出生长速率快的优势微藻单细胞； (3) 用0.lg/L的尼罗红荧光染料Nile/DMSO对步骤（2)中筛选得到生长速率快的微藻 单细胞进行染色，尼罗红荧光染料终浓度达到〇.lmg/L，染色时间7min;将染色藻细胞置于 荧光显微镜的载物台上，在EX450-490nm波长下结合图像处理软件观察测量藻细胞的荧 光强度，测量视野中所有藻细胞的面积以及细胞内所有油滴的面积，计算藻细胞的油脂含 量，从而筛选出油脂含量高的优势微藻单细胞； 油脂含量的计算方法为：
油脂含量 其中A。为藻细胞的面积总和（ym2)，怂为细胞中油脂颗粒 ? 的面积总和（ym2)。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基的组分及配比关系为：0. 15g NaHC03、0.02gKH2P04、0.027gVBpl.SXIO-egVB12、0.2gNa2Si03.9H20、1.0gNaN03、 0? 0005gBiotin、lmL微量元素和980mL人工海水。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微量元素的组分及配比关系 为：1000mL蒸馏水中含有 4. 35gNa2EDTA、7. 3mgNa2Mo04 ? 2H20、12mgCoCl2 ? 6H20、3. 9g FeC6H507 ? 5H20、10mgCuS04 ? 5H20、23mgZnS04、178mgMnCl2 ? 4H20 和 600mgH3B03〇
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述人工海水的组分及配比关系为 (盐度=3.0%) :1000mL蒸馏水中含有 21.2157gNaCl、3.407gNa2S04、0.3577gKC1、 9.3042gMgCl2.6H20、1.3044gCaCl2、0.0862gKBr、0.0226gH3B03、0.2760gNaF和0.0219g SrCl2 ? 6H20〇
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻液体中的藻种是下述任意一种： 从自然环境中筛选得到的天然藻种、物理化学诱变得到的藻种突变体或经过基因改良得到 的转基因藻种。
【专利摘要】本发明涉及生物质能利用技术，旨在提供荧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法。该荧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法包括步骤：取微藻液体进行单细胞分离，然后进行扩大培养，获得许多株单细胞藻液，再将单细胞藻液接种至96孔板培养至稳定期后，筛选出生长速率快的优势微藻单细胞，用尼罗红荧光染料Nile/DMSO染色后，计算藻细胞的油脂含量，从而筛选出油脂含量高的优势微藻单细胞。本发明能够在10分钟左右对96孔板的藻细胞快速筛检出生长速率快和油脂含量高的优势藻株，大大提高了筛选目标藻株的工作效率，减少了劳动时间成本。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104568881
【申请号】CN201410844238
【发明人】程军, 岑可法, 周俊虎, 刘建忠, 杨卫娟, 张彦威, 黄镇宇, 周志军, 王智化
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日