基于led光源的随机光学重建显微成像系统及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种显微技术领域的随机光学重建显微成像技术，具体涉及一种基于LED光源的随机光学重建显微成像系统及方法。
【背景技术】
[0002]随机光学重建显微成像技术(StochasticOptical Reconstruct1nMicroscopy,以下简称STORM)是一种重要的超分辨显微手段，STORM过程包括若干周期，在每个周期内只有随机性的少量荧光分子发出荧光，通过函数拟合的办法实现单分子荧光成像(F1NA)，循环若干周期后组合获得图像，从而实现超分辨成像。Michael J Rust等人实现的STORM横向分辨率可以达到20nm。
[0003]具体以Cy3_Cy5荧光分子对为例进行说明，在该对组合中Cy3作为激发物质Cy5作为报告物质。花青素染剂Cy3的吸收光谱峰值波长为532nm，Cy5的吸收光谱峰值波长为633nm。在显微观察前，首先将待观察样品用染剂染色，然后用波长为633nm的红光照射样品使其发射荧光后全部转化为非荧光状态(关状态)，采用波长为532nm的绿光激发Cy3，从而使Cy5处于荧光状态(开状态)。激发过程中应使绿光强度足够低，以保证在衍射极限范围内至多只有一个Cy5荧光分子被激发至荧光状态。而后，用波长为633nm的红色激光照射待观察样品，使处于荧光状态的Cy5分子发射荧光。通过电子相机读取荧光图像，采用函数拟合的方法对图像进行处理，进而确定每个荧光点的其中心位置。经过足够多次数循环后对获得的荧光点位置你进行叠加，最终得到超分辨显微图像。因此，整个成像过程中，激光光强调节和不同激光之间的切换是关键的步骤，成像过程示意如图1-2所示。
[0004]对于随机光学重建显微技术，国内的研宄尚处于起步阶段。目前的STORM系统均采用激光光源，且激活激光和激发激光均采用的是物镜聚焦，其结构如图3所示，主要包括了多个激光器1、偏振分束镜(PBS)、滤光片(F)、反射镜(M)、透镜(L)、二向色镜(DM)、物面(OBJ)、探测器(CCD)和声光可调滤光器(AOTF)。
[0005]而国外对STORM技术的研宄相对于国内更加深入和全面，主要包括2D成像、3D和全细胞成像、多颜色染剂成像等。同时，一些结构的应用如双物镜、全内反射荧光显微镜等也提高了 STORM的分辨能力，如哈佛大学的Bo Huang等人对组织进行了 3D STORM成像。并且国外已经有多家厂商推出了成熟的STORM产品，如尼康(Nikon)公司的N-ST0RM，蔡司(Zeiss)公司的STORM产品等，根据不同配置价格在人民币180-300万元不等，高昂的价格限制了广泛应用。
[0006]目前，所有的国内外随机光学重建显微技术研宄，以及上述成熟商业设备中，实验装置的搭建均采用激光光源，虽然获得了较高的分辨率、信噪比和成像速度，但是激光光源成本较高，而且一套系统即需要多个激光光源，很难降低成本。
【发明内容】
[0007]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种可以降低成本的基于LED光源的随机光学重建显微成像系统，同时还提供了一种采用该系统的基于LED光源的随机光学重建显微成像方法。
[0008]为了达到上述目的，本发明的技术方案如下:
[0009]基于LED光源的随机光学重建显微成像系统，包括载物台、CXD探测器和物镜，其还包括:
[0010]多个LED光源，其分别形成多路光线传输路径，该LED光源和物镜之间还设置有滤光片、二向色镜和多个透镜，LED光源的光线通过该滤光片、二向色镜和多个透镜到达物镜;
[0011]控制电路，其连接LED光源，用于调节该LED光源的光强，同时形成多个LED光源之间的切换。
[0012]本发明的系统通过设置控制电路和LED光源，实现了光强调节和光源切换的两大功能，从而可以替代现有技术中作为实现光强调节功能的激光器、半波片和偏振分束镜，另外还可以替代现有技术中作为实现光源切换的声光可调滤光器。采用激光光源时，每个光源均需一套(声光可调滤光器只需要一套，半波片和偏振分束镜是每个激光器均需一套)，体积大且会导致光路调节繁琐，增加成本，本发明采用电调节方式，可以方便调节光强；现有技术使用AOTF，价格很高，大大增加系统成本，并且光效率很低，浪费很多激光能量，本发明取消AOTF后便可以解决这一问题；由于STORM为通过对单分子荧光拟合方法获得单分子位置，因此本发明的LED光源与现有技术的激光相比，不会降低分辨率，而且LED光源为ns级激发速度，不会影响成像速度。
[0013]因此，本发明相比于现有技术，在保证成像质量的同时，还可以大大地降低成本。
[0014]在上述技术方案的基础上，本发明还可以作如下改进:
[0015]作为优选的方案，上述的控制电路通过调节LED光源的电流大小来调节该LED光源的光强。
[0016]采用上述优选的方案，通过调节电流大小这种方式，便可以控制LED光源的照射强度，从而达到调节光强的目的。
[0017]作为优选的方案，上述的控制电路通过调节LED光源的电压大小来调节该LED光源的光强。
[0018]采用上述优选的方案，通过调节电压大小这种方式，便可以控制LED光源的照射强度，从而达到调节光强的目的。
[0019]作为优选的方案，上述的控制电路通过控制LED光源的电源通断来形成该LED光源之间的切换。
[0020]采用上述优选的方案，通过控制电源通断这种方式，便可以形成多个LED光源之间的切换，从而达到切换LED光源的目的。
[0021]基于LED光源的随机光学重建显微成像方法，使用如上所述的基于LED光源的随机光学重建显微成像系统，该方法包括，设置多个LED电源，并通过滤光片、二向色镜和多个透镜到达物镜，设置并通过控制电路来调节LED电源的光强，同时形成多个LED光源之间的切换。
[0022]本发明的方法通过设置控制电路和LED光源，实现了光强调节和光源切换的两大功能，从而可以替代现有技术中作为实现光强调节功能的激光器、半波片和偏振分束镜，另外还可以替代现有技术中作为实现光源切换的声光可调滤光器采用激光光源时，每个光源均需一套，体积大且会导致光路调节繁琐，增加成本，本发明采用点调节方式，可以方便调节光强；现有技术使用AOTF，价格很高，大大增加系统成本，并且光效率很低，浪费很多激光能量，本发明取消AOTF后便可以解决这一问题；由于STORM为通过对单分子荧光拟合方法获得单分子位置，因此本发明的LED光源与现有技术的激光相比，不会降低分辨率，而且LED光源为ns级激发速度，不会影响成像速度。
[0023]因此，本发明相比于现有技术，在保证成像质量的同时，还大大地降低成本。
[0024]作为优选的方案，上述的控制电路通过调节LED光源的电流大小来调节该LED光源的光强。
[0025]采用上述优选的方案，通过调节电流大小这种方式，便可以控制LED光源的照射强度，从而达到调节光强的目的。
[0026]作为优选的方案，上述的控制电路通过调节LED光源的电压大小来调节LED光源的光强。
[0027]采用上述优选的方案，通过调节电压大小这种方式，便可以控制LED光源的照射强度，从而达到调节光强的目的。
[0028]作为优选的方案，上述的控制电路通过控制LED光源的电源通断来形成该LED光源之间的切换。
[0029]采用上述优选的方案，通过控制电源通断这种方式，便可以形成多个LED光源之间的切换，从而达到切换LED光源的目的。
【附图说明】
[0030]图1和图2为随机光学重建显微成像技术的成像原理图。
[0031]图3为现有的随机光学重建显微成像系统的结构示意图。
[0032]图4为本发明的基于LED光源的随机光学重建显微成像系统的结构示意图。
[0033]图5为本发明的基于LED光源的随机光学重建显微成像方法的结构示意图。
[0034]图6为本发明的基于LED光源的随机光学重建显微成像系统及方法中所涉及的控制电路的结构示意图。
[0035]其中，1.激光器PBS.偏振分束镜F.滤光片M.反射镜L透镜DM.二向色镜OBJ.物面(XD.探测器A0TF.声光可调滤光器2.LED光源3.控制电路。
【具体实施方式】
[0036]下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。
[0037]为了达到本发明的目的，如图4和6所示，在本发明的基于LED光源的随机光学重建显微成像系统的其中一些实施方式中，设置了载物台(即物面OBJ)、CCD探测器和物