专利名称：随机光学重建荧光显微镜的制作方法
技术领域：
本实用新型关于一种提供高于传统光学衍射极限分辨率(200nm)的随机光学重建荧光显微镜，特别是涉及一种利用宽谱光源作为荧光分子活化的光源，基于单荧光分子检测和中心定位技术的超高分辨率的随机光学重建荧光显微镜。
背景技术：
传统荧光显微镜在生物和医学研究中发挥着重要的作用，是生命科学研究的必备工具。但是，传统光学显微镜的分辨率受光学衍射极限的限制，难以实现高于200nm的分辨率。近年来，哈佛大学及其它大学的几位学者提出可以将荧光分子活化与单分子中心定位技术相结合，突破光学衍射极限，实现纳米尺度的分辨率(20-50nm)。这种技术的核心是通过特定波长的光照射使荧光分子发光并且进入暗态，然后用另一波长的活化光使暗态的荧光分子活化重新具备发光的能力，通过控制活化光的功率密度，使得成像区域中随机恢复的荧光分子之间的距离大于光学衍射极限，从而能被传统光学显微镜分辨。连续记录这些单个荧光分子的图像，并进行单分子中心精确定位，最后通过重建获得具有纳米尺度分辨率的荧光图像。对于传统的商业或研究用随机光学重建显微镜(STORM), —般的激发光光源和活化光光源都用激光器，通过声光可调滤光器(AOTF)的控制进行激发光和活化光的照明。然而，这种方法的缺点是激光器或声光可调滤光器的价格比较昂贵，成本较高。
实用新型内容基于随机光学重建的概念，同时为了克服现有超高分辨率显微镜的复杂性和高成本，本实用新型之一目的在于提供一种新的随机光学重建荧光显微镜系统，其通过外置照明系统与荧光显微镜组合，将普通倒置荧光显微镜改造为一台提供纳米分辨率的超高分辨显微镜，且其成本大大低于商品化的同类显微镜产品。为达上述及其它目的，本实用新型提出一种随机光学重建荧光显微镜，包括用于放置样品的载物台，紧挨该载物台下方设置的物镜，其中，该显微镜还包括:双滤光片层，设置于该载物台下方，包含两层电动转换的滤光片盒；活化光光源产生模块，用于产生活化光光源，产生的光源经扩束、聚焦后，经该双滤光片层的一层电动滤光片盒的二向色镜及该物镜后照于该载物台的样品表面；以及激发光光源产生模块，产生激发光，经扩束、聚焦后，经该双滤光片层的另一电动滤光片盒的二向色镜及物镜后照于该载物台的样品表面。进一步地，该活化光光源产生模块的光源利用汞灯或金属卤素灯或LED灯产生。[0011 ] 进一步地，该光源经过显微镜自带通道，扩束、聚焦后，从上层右口导入，经上层电动滤光片盒的二向色镜、物镜后照在样品表面进行照明，提供活化光。进一步地，该上层电动滤光片盒中的二向色镜周期性转换，提供周期性的活化光。进一步地，该显微镜利用一电动快门加在活化光源前以提供周期性的活化光。[0014]进一步地，该激发光光源产生模块包括激光产生器、扩束装置及聚焦装置，该激光产生器激发光，经过该扩束装置扩束、该聚焦装置聚焦后，经该双滤光片层的另一电动滤光片盒的二向色镜及物镜后照于该载物台的样品表面。进一步地，该激光产生器为半导体激光器，该半导体激光器经过扩束、聚焦，从该显微镜的后口进入该显微镜，经底层滤光片盒的二向色镜、物镜后照于样品表面。进一步地，该显微镜于成像过程中，通过红外光照在样品表面反射回的信息对物镜的高度做实时调整，以防止因样品漂移而产生垂直方向失焦现象。进一步地，该显微镜于普通单滤光片层的倒置荧光显微镜上改造而成。与现有技术相比，本实用新型一种随机光学重建荧光显微镜通过于普通的单滤光片层的荧光显微镜增加一层电动转换的滤光片盒，并利用汞灯等宽谱、便宜的光源作为随机光学重建显微镜活化光光源，实现了将一台普通倒置荧光显微镜改造为一台超高分辨显微镜的目的，大幅降低了实现超高分辨成像所需要的成本。
图1为本实用新型一种随机光学重建荧光显微镜的结构示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例并结合附图说明本实用新型的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本实用新型的其它优点与功效。本实用新型亦可通过其它不同的具体实例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不背离本实用新型的精神下进行各种修饰与变更。图1为本实用新型一种随机光学重建荧光显微镜的结构示意图。如图1所示，本实用新型一种随机光学重建荧光显微镜，是在普通倒置荧光显微镜上进行改造形成的，该普通倒置荧光显微镜为单滤光片层的显微镜，本实用新型之随机光学重建荧光显微镜，包括:载物台10、双滤光片层11、活化光光源产生模块12以及激光光光源产生模块13。其中载物台10用于放置试样，紧挨着载物台10下方设有物镜(图中未示出)，双滤光片层11，设置于载物台下方，是在原有的单滤光片层基础上增加一层电动转换的滤光片盒形成的，一层用于走激光光路，一层走活化光光路；活化光光源产生模块12，用于产生活化光光源，其产生的光源经过扩束、聚焦后，经双滤光片层11的一电动滤光片盒的二向色镜及物镜后照在载物台10上的样品表面进行照明，提供活化光，活化光光源产生模块12可利用汞灯产生活化光光源，也可以利用金属卤素灯、LED灯等宽谱、便宜的光源，在本实用新型较佳实施例中，活化光光源产生模块12的光源为一 100W的汞灯光源，汞灯光源经过显微镜自带通道，扩束、聚焦后，从上层右口导入，经上层电动滤光片盒的二向色镜、物镜后照在样品表面进行照明，提供活化光；激发光光源产生模块13，包括激光产生器130、扩束装置131及聚焦装置132，激光产生器130用于产生激发光光源，其经过扩束装置131扩束、聚焦装置132聚焦后，经双滤光片层11的另一电动滤光片盒的二向色镜及物镜后照在载物台10上的样品表面进行照明，提供激发光，在本实用新型较佳实施例中，激光产生器130为半导体激光器，半导体激光器经过扩束、聚焦，从显微镜的后口进入显微镜，经底层滤光片盒的二向色镜、物镜后照在样品表面进行照明，提供激发光。当然，除此之外，与普通倒置荧光显微镜一样，本实用新型之随机光学重建荧光显微镜还需CCD图像传感器，在此不予赘述。成像过程中，通过红外光照在样品表面反射回的信息对物镜的高度做实时调整，以防止因样品漂移而产生垂直方向失焦现象。成像过程中，可利用Micro Manager软件控制上层自动滤光片盒中的二向色镜周期性的转换，提供周期性的活化光，以满足STORM的成像要求，也可通过在活化光源前增加一电动快门以提供周期性的活化光，满足STORM的成像要求。综上所述，本实用新型一种随机光学重建荧光显微镜通过于普通的单滤光片层的突光显微镜增加一层电动转换的滤光片盒，并利用萊灯等宽谱、便宜的光源作为随机光学重建显微镜活化光光源，实现了将一台普通倒置荧光显微镜改造为一台超高分辨显微镜的目的，分辨率达到几十纳米。上述实施例仅例示性说明本实用新型的原理及其功效，而非用于限制本实用新型。任何本领域技术人员均可在不违背本实用新型的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本实用新型的权利保护范围，应如权利要求书所列。
权利要求1.一种随机光学重建荧光显微镜，包括用于放置样品的载物台，紧挨该载物台下方设置物镜，其特征在于，该显微镜还包括: 双滤光片层，设置于该载物台下方，包含两层电动转换的滤光片盒； 活化光光源产生模块，用于产生活化光光源，产生的光源经扩束、聚焦后，经该双滤光片层的一层电动滤光片盒的二向色镜及该物镜后照于该载物台的样品表面；以及 激发光光源产生模块，产生激发光，经扩束、聚焦后，经该双滤光片层的另一电动滤光片盒的二向色镜及物镜后照于该载物台的样品表面。
2.如权利要求1所述的一种随机光学重建荧光显微镜，其特征在于:该活化光光源产生模块的光源利用汞灯或金属卤素灯或LED灯产生。
3.如权利要求2所述的一种随机光学重建突光显微镜，其特征在于:该光源经过显微镜自带通道，扩束、聚焦后，从上层右口导入，经上层电动滤光片盒的二向色镜、物镜后照在样品表面进行照明，提供活化光。
4.如权利要求3所述的一种随机光学重建突光显微镜,其特征在于:该上层电动滤光片盒中的二向色镜周期性转换，提供周期性的活化光。
5.如权利要求3所述的一种随机光学重建突光显微镜,其特征在于:该显微镜利用一电动快门加在活化光源前以提供周期性的活化光。
6.如权利要求1所述的一种随机光学重建突光显微镜，其特征在于:该激发光光源产生模块包括激光产生器、扩束装置及聚焦装置，该激光产生器激发光，经过该扩束装置扩束、该聚焦装置聚焦后，经该双滤光片层的另一电动滤光片盒的二向色镜及物镜后照于该载物台的样品表面。
7.如权利要求6所述的一种随机光学重建突光显微镜,其特征在于:该激光产生器为半导体激光器，该半导体激光器经过扩束、聚焦，从该显微镜的后口进入该显微镜，经底层滤光片盒的二向色镜、物镜后照于样品表面。
8.如权利要求1所述的一种随机光学重建突光显微镜，其特征在于:该显微镜于普通单滤光片层的倒置荧光显微镜上改造而成。
专利摘要本实用新型公开了一种随机光学重建荧光显微镜，包括载物台、CCD及紧挨载物台下方的物镜，其中，该显微镜还包括双滤光片层，设置于该载物台下方，包含两层电动转换的滤光片盒；活化光光源产生模块，用于产生活化光光源，产生的光源经扩束、聚焦后，经该双滤光片层的一层电动滤光片盒的二向色镜及该物镜后照于该载物台的样品表面；以及激发光光源产生模块，产生激发光经扩束、聚焦后，经该双滤光片层的另一电动滤光片盒的二向色镜及物镜后照于该载物台的样品表面，本实用新型可以使得传统荧光显微镜的分辨率从光学衍射极限(200nm)提高到纳米尺度(20-50nm)，且实现的成本远低于目前的商业化超高分辨率显微镜产品。
文档编号G02B21/06GK202956343SQ20122063341
公开日2013年5月29日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者邵志峰, 李小卫, 袁志伟, 翟人宽, 孙洁林 申请人:上海交通大学