薄层石墨烯荧光猝灭结合纳米金属阵列进行单分子荧光观测的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物物理单分子观测表面处理技术领域，具体涉及一种单分子荧光观测方法。
【背景技术】
[0002]单分子实验是目前生物应用方面备受瞩目的观测技术，例如利用荧光染料或荧光蛋白标记并观测单个目标分子等方法，可以得到过去在多分子实验中被平均化而煙没的信息。但是，目前为止要在玻璃为衬底的纳米结构阵列上实现透射型单分子观测遇到了很大的问题。通常来说，要进行纳米结构阵列上的透射型单分子荧光观测，需要具备以下条件:I)衬底透明，不会过多损耗激励光及荧光信号，从而完成透射型观测；2)需要对表面进行处理从而避免荧光分子非特异性结合在除目标位置(纳米结构阵列)外的其他区域，影响单分子荧光观测；3)对表面不同区域的处理操作不会相互干扰(例如为增加特异性结合效率而对目标位置进行的表面处理不会破坏其他区域的已有结构)。
[0003]为满足第一条要求，通常选用玻璃作为衬底进行实验，相应的为了防止非特异性的荧光分子的结合，通常使用修饰后的聚乙二醇等聚合物，通过自组装的方式在玻璃表面形成可防止荧光分子结合的薄膜。但这样的方式也面临着一些问题:1.首先聚合物分子成膜的条件较为苛刻，环境PH值、温度、浓度等因素都会影响其成膜的质量，从而影响其阻止结合的功能；2.其次，在进一步加工制作纳米结构阵列时，对于阵列表面的处理通常因为聚合物薄膜易被破坏而难以实现。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提出一种高效率的单分子荧光观测方法。
[0005]本发明提出的单分子荧光观测方法，使用薄层石墨烯为衬底，结合纳米金属阵列，在猝灭非特异性结合的荧光分子的同时可不影响对纳米金属的再修饰，从而进行高效率的单分子荧光观测。具体步骤为:
Cl)单分子荧光观测区域表面的处理:
Ca)选用玻璃薄片(一般玻片厚度约为0.15-0.20mm),用浓硫酸及双氧水混合物(一般两者重量比为2:1至4:1)对其进行表面清洗；
(b)用高纯氮气吹干玻璃薄片，然后使用透明胶带将石墨烯转移至玻片表面，转移的石墨烯在玻片表面有一部分为薄层(其厚度小于3层原子层)；
(2)在上述石墨烯衬底上制备纳米金属有序阵列:
(a)在上述玻片表面，用旋涂法涂覆胶层PMMA (即聚甲基丙烯酸甲酯)，于光学显微镜下在胶层上划出薄层石墨烯的位置，用电子束法蒸镀铝膜(膜厚为5-10nm)，然后在薄层石墨烯位置处进行电子束曝光(EBL )，写出设计的纳米结构阵列； (b)用化学溶液浸泡经上述处理的物品，去掉铝膜，所用化学溶液为3038正胶显影液和去离子水的混合液，3038正胶显影液与去离子水的重量比为1:3到1:5 ;
(c)用显影液显去PMMA:显影液预冷至0-4°C，低温显影约30-40min，所用显影液为MIBK和IPA的混合液，混合液中，MIBK和IPA的重量比为1:2到1:4 ;
(d)用电子束法蒸镀一金属层(具体材料取决于实验选用的荧光物质及使用方法，一般为金或银)，用以隔开荧光分子和石墨烯，该金属层厚度为15-20nm，优选为约18nm ;再用丙酮浸泡，超声除去多余的金属膜及PMMA ；
Ce)电镜下拍照，确定阵列完整性等情况。
[0006]薄层石墨烯可猝灭表面一定区域内的荧光分子且本身较透明，不会损耗过多的激励光和荧光信号。荧光分子可正常结合在石墨烯衬底上的纳米金属阵列上，且因不在石墨烯猝灭范围内而正常发出荧光。通过控制荧光分子浓度及结合条件即可实现单分子荧光观测，具体的观测实施方式如图4所示。
[0007]实验表明，石墨烯厚度小于3层且金属层厚度大于等于18nm时，纳米结构上吸附的荧光分子不会被石墨烯猝灭，可以正常进行单分子观测。观测方式如图4所示。
【附图说明】
[0008]图1为石墨烯的形貌图。其中，左图为明场下单层石墨烯的形貌图(图中箭头标示的部分有单层石墨烯覆盖)，右图为TIRF下观察的图像。
[0009]图2所示为TIRF下的观察结果。其中，a及b中箭头指示的为石墨烯碎片，c为IFP1.4同样浓度下玻璃表面/ (3nm Cr + 15nm Au)表面/ (石墨稀碎片+3nm Cr + 15nmAu)表面分别的荧光强度统计值，d图每一组柱状图(相邻的条纹柱形和全填充柱形)为同一位置的石墨烯碎片处及附近仅金层处的荧光强度平均值，每一组的石墨烯厚度存在差升。
[0010]图3为薄层石墨烯表面制备完成的纳米金结构阵列图示。其中，a为约40倍放大下微纳制作完成后的阵列位置明场示意图，图中方形框框出的部分即为纳米阵列所在位置，b图为a图中圆圈圈定区域在SEM下的放大图像，c图及d图分别为SEM下分辨率为Ium及200nm的放大图像。
[0011]图4为单分子观测方式图示。
【具体实施方式】
[0012]以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0013]实施例1:石墨烯对荧光的猝灭
1、首先通过化学气相沉积方法转移单层石墨烯至清洁后的玻璃玻片表面，石墨烯覆盖面积约为Icm2;
2、在石墨烯表面加荧光蛋白溶液(此处使用的是IFP1.4荧光蛋白，浓度约400nM)，冲洗掉多余的荧光蛋白后在全内反射荧光显微镜(TIRF)下观察。
[0014]如图1所示，左图为明场下单层石墨烯的形貌图(图中红色箭头标示的部分有单层石墨烯覆盖)，右图为TIRF下观察的图像。从右图可以看出，有单层石墨烯覆盖的地方没有明显荧光信号，说明直接粘附在石墨烯上的荧光分子被猝灭，无法发出荧光。
[0015]实施例2:石墨烯厚度对荧光猝灭的影响
1、首先通过透明胶带将石墨烯转移到清洗过后的玻片上；
2、在步骤I处理后的玻片上蒸镀3nmCr + 15nm Au，用以隔开焚光分子和石墨稀；
3、在玻片上加IFP1.4的溶液(浓度约400nM)，一段时间后冲洗去多余的荧光分子，在TIRF下观测有石墨烯碎片的区域。
[0016]图2所示为TIRF下的观察结果，a及b图中红色箭头指示的为石墨烯碎片，可见这一薄层碎片覆盖的区域仍能明显观察到IFP1.4的荧光信号，说明薄层石墨烯并不影响荧光观察。c图为IFP1.4同样浓度下玻璃表面/ (3nm Cr + 15nm Au)表面/ (石墨烯碎片+3nm Cr + 15nm Au)表面分别的焚光强度统计值，可以看出不同厚度的石墨稀碎片上的荧光强度的平均值确实低于仅有铬金层玻片的对照组，但从后面的d图(每一组黑色及红色柱状图为同一位置的石墨烯碎片处及附近仅金层处的荧光强度平均值，每一组的石墨烯厚度存在差异)可以看出，不同厚度的石墨烯碎片对于荧光物质的猝灭范围不同，石墨烯越厚能够猝灭荧光的范围越大，相应观测到的荧光强度越小。而薄层石墨烯能够猝灭的范围较小，从而观测到的荧光强度较大(如d图蓝色框出的一组石墨烯薄层即对应于a及b图所示的石墨稀薄层)。
[0017]实施例3:在石墨烯薄层上制备纳米金结构阵列，以用于单分子荧光观测实验
1、首先选用玻璃薄片(厚度仅约0.17_)，用浓硫酸及双氧水混合物(7:3)进行表面清洗；
2、高纯氮气吹干后，使用透明胶带将石墨烯转移至玻片表面，转移的石墨烯在玻片表面有一部分为薄层(小于3层厚度)；
3、在玻片表面旋转涂胶(PMMA)，光学显微镜下在胶层上划出薄层石墨烯的位置，电子束蒸镀铝膜(约7nm)后在薄层石墨烯位置处进行电子束曝光(EBL)写出设计的纳米结构阵列；
4、在化学溶液中浸泡去掉铝膜，化学溶液为3038正胶显影液:去离子水=1:4
5、在显影液中显去PMMA，显影液需预冷至O°C，低温显影约30-40min，显影液为MIBK:1PA=1:3;
6、电子束蒸镀3nmCr + 15nm Au，丙酮浸泡超声除去多余的PMMA ;
7、电镜下拍照确定阵列完整性等情况。
[0018]图3所示即为薄层石墨烯表面制备完成的纳米金结构阵列。b图为a图中圈定区域在SEM下的放大图像，c图及d图分别是SEM下分辨率为Ium及200nm的放大图像。结果表明在石墨烯上可以完整制备出百纳米量级的结构阵列。
【主权项】
1.一种薄层石墨烯荧光猝灭结合纳米金属阵列进行单分子荧光观测的方法，其特征在于:使用薄层石墨烯为衬底，结合纳米金属阵列，在猝灭非特异性结合的荧光分子的同时可不影响对纳米金属的再修饰，从而进行高效率的单分子荧光观测；具体步骤为: (1)单分子荧光观测区域表面的处理: Ca)选用玻璃薄片，用浓硫酸及双氧水混合物对其进行表面清洗； (b)用高纯氮气吹干玻璃薄片，然后使用透明胶带将石墨烯转移至玻片表面，转移的石墨烯在玻片表面有一部分为薄层，其厚度小于3原子层； (2)在上述石墨烯衬底上制备纳米金属有序阵列: (a)在上述玻片表面，用旋涂法涂覆胶层PMMA，于光学显微镜下在胶层上划出薄层石墨烯的位置，用电子束法蒸镀铝膜，然后在薄层石墨烯位置处进行电子束曝光，写出设计的纳米结构阵列； (b)用化学溶液浸泡经上述处理的物品，去掉铝膜，所用化学溶液为3038正胶显影液和去离子水的混合液，3038正胶显影液与去离子水的重量比为1:3到1:5 ; (c)用显影液显去PMMA:显影液预冷至0-4°C，低温显影30-40min，所用显影液为MIBK和IPA的混合液，混合液中，MIBK和IPA的重量比为1:2到1:4 ； Cd)用电子束法蒸镀一金属层，该金属层厚度为15-20nm ;再用丙酮浸泡，超声除去多余的金属膜及PMMA ； Ce)电镜下拍照，确定阵列完整性情况。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述金属层材料为金或银。
【专利摘要】本发明属于生物物理单分子观测表面处理技术领域，具体为一种薄层石墨烯荧光猝灭结合纳米金属阵列进行单分子荧光观测的方法。本发明具体步骤包括：单分子荧光观测区域表面的处理；在上述石墨烯衬底上制备纳米金属有序阵列。本发明利用薄层石墨烯可猝灭其表面一定区域内的荧光分子，同时拥有良好的透过性，使得激励光和荧光信号的损耗较小的性质；在薄层石墨烯上的金属纳米结构可正常结合荧光分子，而金属层纵向上拉开了荧光分子和石墨烯的距离，使得荧光分子不在石墨烯猝灭范围内而能够正常发出荧光。通过控制荧光分子浓度及结合条件即可实现单分子荧光观测。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104568876
【申请号】CN201410813396
【发明人】赵文琦, 刘帆, 田筱超然, 邱孟, 周磊, 谭砚文, 张远波
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月24日