一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法及其应用

一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法及其应用，一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法，主要包括以下步骤：（1）采用高温煅烧法制备碳量子点溶液；（2）取不同浓度的谷胱甘肽与钝化剂1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳二亚胺混合5~30 min，接着加入到碳量子点溶液中反应10~30 min，然后进行荧光分析；（3）记录钝化后碳量子点溶液在360 nm激发波长下的荧光光谱图，分析不同浓度谷胱甘肽下钝化后碳量子点溶液荧光强度的变化。本发明提出了一种新型的利用钝化碳量子点的用于检测谷胱甘肽的荧光分析方法。且方法制备过程环保、快速、简便，不需要过于复杂的仪器，是一种兼具便捷性和实际应用前景的谷胱甘肽检测方法。
【专利说明】
一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及属于新型功能材料、生物小分子分析新领域，尤其涉及一种基于钝化 碳量子点荧光分析方法，及其在血清、化妆品、水果中谷胱甘肽检测的应用。
【背景技术】
[0002] 谷胱甘肽在生命体的各种新陈代谢过程中扮演着重要的角色，它们在人体中的含 量跟许多疾病息息相关，因此，对生命体中谷胱甘肽进行定性定量检测具有非常重要的意 义。因此，研究生命体中谷胱甘肽的检测方法显得尤为重要。目前用于检测谷胱甘肽的方法 主要有:质谱、高效液相色谱、电化学、荧光分析等其中，质谱与色谱方法虽然有较高的灵敏 度，检测速度快，分析时间短的优点，但检测程序复杂，需要专业的人才可以操作。电化学方 法需要在电极上对巯基化合物进行电化氧化处理，其过程复杂，耗时较长，需要很大的过电 压，将其应用于活细胞中，实现定位和定时检测目标物还有待进一步研究，难度较大。荧光 分析法除具有灵敏度高，简单方便等优点外，还具有一个显著的优势就是可以实现对细胞 内谷胱甘肽的检测。
[0003] 近年来，半导体量子点（CdTe/CdSe等）以其出色的光学性质得到了研究者们广泛 的关注。目前，人们已经利用量子点设计了许多可以检测金属离子、非金属离子，有机小分 子以及与生命相关物质的荧光传感器。但CdTe/CdSe等量子点合成过程对实验操作人员有 一定危害，同时CdTe/CdSe等量子点都含有有毒的重金属，生物相容性差。
[0004] 作为一种新型碳纳米材料，碳量子点的光致发光机制现在还没有确定的解释。Sun 等将碳量子点的光致发光特性归因于表面能量陷阱，从而解释了表面钝化剂对碳量子点荧 光性能增强的原因。Pang等的研究发现，碳量子点的粒径差异也导致了其荧光性能的不同， 而碳量子点的表面缺陷则没有相应的影响。但在后来的研究中，Pang等以碳纤维为碳源，采 用电化学法，氧化碳纤维通过控制电压制备了不同粒径的碳量子点。碳量子点的性能测试 显示，碳量子点的粒径对其荧光性能几乎没有影响，而碳量子点的表面状态对其性能影响 显著。控制氧化电压造成最终的碳量子点具有不同的表面状态(缺陷），而碳量子点表面状 态的不同又引起了荧光性能的差异。Chen等则通过研究推测，光致发光现象可能是由碳量 子点的微观表面缺陷、电子能级结构以及量子限域效应等综合作用的结果。
[0005] 虽然碳量子点的发光机制尚没有明确，但大量研究显示，表面经有机物钝化处理 后，碳量子点的荧光性能确实可以大大提高。因此整体来看，碳量子点的光致发光现象可能 不仅取决于碳量子点的粒径情况，更与碳量子点的表面钝化状态(表面缺陷)紧密相关。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法及其应用，以克服 现有量子点合成过程对实验操作人员有一定危害，且含有有毒的重金属及生物相容性差等 问题。
[0007] 本发明采用的技术方案是：一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法，主要包括以 下步骤： (1) 采用高温煅烧法制备碳量子点溶液； (2) 取不同浓度的谷胱甘肽与钝化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)混合 5~30 min，接着加入碳量子点溶液中反应10~30 min，然后进行荧光分析； (3) 记录钝化后碳量子点溶液在360nm激发波长下的荧光光谱图，分析不同浓度谷胱甘 肽下钝化后碳量子点溶液荧光强度的变化。
[0008] 高温煅烧法制备的碳量子点表面基团较少，荧光量子产率较低。与其他方法合成 出来的碳量子点相比无优势，在发光性质上甚至是劣势。但是其在EDC钝化后荧光量子产率 能达到41.1%，比大部分用其他方法合成出来的碳量子点荧光产率高。
[0009] 进一步的，步骤（1)所述高温煅烧法制备碳量子点溶液主要包括:在180~220°C马 弗炉中对柠檬酸进行高温煅烧20~45 min，将得到的淡黄色液体冷却至室温;再用碱性试剂 溶解，将pH调至中性。直接高温煅烧柠檬酸得到的碳量子点pH为1左右。
[0010] 进一步的，所述碱性试剂为NaOH或者Κ0Η。用NaOH或者Κ0Η是为了调pH至中性，同时 不引入其他可能会有影响的干扰离子。
[0011]进一步的，每 10 yL 0.03~0.05 mg mL-1 碳量子点溶液，添加 100 yL 200 mmol L一1 钝化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
[0012] 进一步的，所述荧光分析的条件为PH为7 · 0~7 · 8 JDC在pH为7 · 0~7 · 8环境下钝化碳 量子点，效果较好。
[0013] 进一步的，所述谷胱甘肽、所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺均用pH为 7.0~7.8的10 mmol L-1 PBS缓冲溶液配制。
[0014] 进一步的，所述NaOH或Κ0Η的浓度为50~200 mg mL-1。
[0015] 进一步的，所述碳量子点的粒径分布为2.0~5.0 nm。
[0016] -种上述荧光分析方法的应用，用于在血清、化妆品或水果中检测谷胱甘肽。
[0017] 不同于以往其他荧光分析法通过猝灭基团猝灭发光基团或者荧光共振能量转移 的方式来构建荧光传感器。本发明发现一种通过高温煅烧柠檬酸得到的碳量子点可以通过 EDC的钝化来提高其荧光强。EDC引入碳量子点表面，促进了碳量子点的表面能的陷阱发射， 进而提高了碳量子点的荧光强度。于是设计了一种通过混合谷胱甘肽与H)C使部分EDC与谷 胱甘肽结合，剩余的EDC参与钝化碳量子点的方案，使碳量子点溶液的荧光强度与谷胱甘肽 的浓度呈一定的线性关系来定量谷胱甘肽的浓度。EDC钝化碳量子点以后，荧光强度增大。 此时再加入谷胱甘肽对碳量子点的荧光强度并无影响。因为碳量子点的表面钝化已经完 成。
[0018] 与现有技术相比，本发明提出了一种新型的利用钝化碳量子点的用于检测谷胱甘 肽的荧光分析方法。而与其它检测方法相比，本发明的方法制备过程环保、快速、简便，不需 要过于复杂的仪器，是一种兼具便捷性和实际应用前景谷胱甘肽检测方法。本发明中1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺钝化后的碳量子点的荧光强度显著增大。荧光量子产率 从0.8%增加至41.1%(以硫酸奎宁为标准参考物质）。实现了高灵敏度检测，所测试得到的线 性范围为1.0~50 μπιο? L-S检测限为0.943 μπιο? L一、
【附图说明】
[0019] 图1为本发明的荧光分析方法的过程示意图； 图2为实施例1合成的碳量子点的高分辨透射电镜图； 图3为实施例1合成的碳量子点在不同激发波长(320~400 nm)下得到的荧光光谱图； 图4为实施例1中为不同的pH环境下对EDC钝化碳量子点的影响； 图5为实施例1中本发明方法检测机理的紫外可见光谱表征图； 图6为实施例1中不同浓度谷胱甘肽与200 mmol I/1 EDC混合反应后加入碳量子点溶 液后的荧光光谱图； 图7为实施例1中不同浓度谷胱甘肽与荧光强度变化比率的线性关系； 图8为干扰物质对实施例1中构建的基于钝化碳量子点的荧光分析方法检测谷胱甘肽 的影响。
【具体实施方式】
[0020] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一 步地详细描述。
[0021] 实施例1 一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法过程如图1所示，主要包括以下步骤： 1)碳量子点的制备。
[0022] 称取2 g柠檬酸固体，倒入15 mL的带盖小烧杯中。然后将小烧杯放置在220°C马弗 炉加热。20分钟后，柠檬酸由固体变成浅黄色的液体，将小烧杯从马弗炉中取出，冷却至室 温。此时小烧杯中的浅黄色液体凝固。向小烧杯中加入2mL NaOH (200 mg ml/1)，在磁力搅 拌下溶解完全后加入8 mL NaOH (200 mg mL-4混合均匀。最后将得到10 mL pH~7碳量子 点溶液储存在4°C冰箱中待用。得到的碳量子点的粒径分布为2.0~5.0 nm。
[0023] 将透析过后的碳量子点溶液稀释至透明无色，取10此滴到200目铜载网微栅支撑 膜(超薄碳膜)上，自然干燥后用Tecnai F20 G2 S-TWIN型高分辨透射电子显微镜测试。由 图2可知，样品的分散性良好，无明显的团聚现象，近似球形。图3为在不同激发波长(320~ 400 nm)下得到的碳量子点的光致发光光谱图。从图3可以看出，在激发波长为360 nm时，荧 光强度最大。由此，本发明选择360 nm为荧光分析的最佳激发波长。为了提高这种荧光传感 器的检测灵敏度，获得最佳检测条件，我们研究了不同pH条件下EDC对碳量子点钝化的影 响。从图4中可以看出，在不同的pH环境下，EDC对碳量子点的钝化作用有一定影响。在偏酸 性的环境下，EDC对碳量子点的钝化作用较弱;在偏碱性的环境下，EDC对碳量子点的钝化作 用较强。从图4中可以看出，在pH为7.0~7.8的时候，EDC对碳量子点的钝化作用最强。因此， 我们选择pH值为7.0~7.8的PBS作为荧光分析的pH。
[0024] 2)谷胱甘肽检测机理的紫外-可见光谱表征 将EDC、谷胱甘肽、EDC钝化后的碳量子点及EDC混合谷胱甘肽后钝化碳量子点溶液在紫 外-可见分光光度计上进行光谱表征。从图3中可以看出，谷胱甘肽(a)与EDC(b)在300~500 nm波长下基本没有吸收，碳量子点溶液(c)在330 nm的波长下有轻微的吸收。在EDC的钝化 下，碳量子点溶液(d)的在361 nm波长下有很强的吸收。当EDC与少量谷胱甘肽混合反应后 加入碳量子点溶液，部分H)C与谷胱甘肽结合，剩余未反应完的EDC钝化碳量子点，此时混合 溶液(e)在361 nm波长下的吸光度明显小于EDC直接钝化的碳量子点溶液(d)。
[0025] 3)谷胱甘肽的检测 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和谷胱甘肽的检测中溶液均用10 mmol I/1 pH 7.0的PBS缓冲溶液配制。100 yL 200 mmol L-^DC加入到1 mL不同浓度（1~100 μπιο? L-工） 的谷胱甘肽溶液中反应5-30分钟。接着，加入10 yL 0.03~0.05 mg mL-1碳量子点溶液反应 10-30分钟。然后用日立F-7000型荧光分光光度计记录荧光强度，选择激发波长360 nm，激 发光狭缝宽度为10 nm，记录荧光光谱，设置光电倍增管电压450 V，扫描速度1200 nm/ min，在380到600 nm的范围内扫描记录体系的荧光性质。如图4所示，不同浓度的谷胱甘肽 (0~100 μπιο? L-3与200 mmol L-1的EDC混合反应后加入碳量子点溶液，得到不同的荧光 曲线。随着谷胱甘肽浓度不断增大，荧光强度逐渐减小。
[0026] 该实验结果表明，随着谷胱甘肽的浓度与荧光强度减弱的比率呈线性关系。如图5 所示，谷胱甘肽的浓度从1.0到50 μπιο? Γ1范围内存在这线性关系。线性方程为(F〇-F)/F〇= 0.0322+5002.443C (C: mol L-其R2=0.9951，通过计算得到检出限为0.943 μπιο? L-\S/ N=3)。其中F〇为200 mmol I/1 EDC活化后碳量子点的荧光强度，F为不同浓度谷胱甘肽与200 mmol I/1 EDC预混合反应后，加入碳量子点后的荧光强度。
[0027] 4)干扰实验 为了考察钝化的碳量子点荧光检测体系对谷胱甘肽的选择性，用氯化镁、氯化钾、甘氨 酸、赖氨酸、丝氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸代替谷胱甘肽在相同的实验条件下进行测试。如图 6实验结果显示，只有谷胱甘肽能够影响碳量子点的钝化程度，使得碳量子点显示出不同的 荧光强度。同时，说明该方法对于谷胱甘肽的检测有着良好的选择性。
[0028] 实施例2 碳量子点的制备 称取2 g柠檬酸固体，倒入15 mL的带盖小烧杯中。然后将小烧杯放置在：180°C马弗炉 加热。45分钟后，柠檬酸由固体变成浅黄色的液体，将小烧杯从马弗炉中取出，冷却至室温。 此时小烧杯中的浅黄色液体凝固。向小烧杯中加入2 mL Κ0Η (50 mg ml/1)，在磁力搅拌下 溶解完全后加入8 mL Κ0Η (50 mg mL-4混合均匀。最后将得到10 mL pH~7碳量子点溶液 储存在4°C冰箱中待用。
[0029]其它的均同实施例1。
[0030] 实施例3 碳量子点的制备 称取2 g柠檬酸固体，倒入15 mL的带盖小烧杯中。然后将小烧杯放置在:220°C马弗炉 加热。20分钟后，柠檬酸由固体变成浅黄色的液体，将小烧杯从马弗炉中取出，冷却至室温。 此时小烧杯中的浅黄色液体凝固。向小烧杯中加入2 mL NaOH (100 mg ml/1)，在磁力搅拌 下溶解完全后加入8 mL NaOH (100 mg ml/1)混合均匀。最后将得到10 mL pH~7碳量子点 溶液储存在4 °C冰箱中待用。其它的均同实施例1 实施例4 人血清中谷胱甘肽的检测。
[0031] 取1 mL人血清样本用10 mmol L-1 pH 7.0的PBS缓冲溶液将血清样品稀释50倍。取 3份进行检测求平均值。然后取9份，分3组，每组添加不同浓度的谷胱甘肽到稀释后的血清 样本中去。分别取上述1 mL样品加入到100 yL 200 mmol I/1 EDC中反应10分钟。接着，加入 10 yL碳量子点溶液反应10分钟。然后用日立F-7000型荧光分光光度计记录荧光强度，选 择激发波长360 nm，激发光狭缝宽度为10 nm，记录荧光光谱，设置光电倍增管电压450 V， 扫描速度1200 nm/min，在380到600 nm的范围内扫描记录体系的荧光性质。测定回收率的 检测结果如表1所示。
[0032] 表1人血清中谷胱甘肽含量的检测
实施例5 化妆品中谷胱甘肽的检测。
[0033] 取1 g自制的化妆品样品(橄榄油、蜂蜡)含0.5%谷胱甘肽，用5 mol L-1氯化钠溶 液稀释至50 mL容量瓶中并剧烈摇晃。在4000 rpm转速下离心20 min取上清液。将上清液用 10 mmol L-1 pH 7.0的PBS缓冲溶液稀释30倍，为检测样品。取3份做检测。分别取3份上述 1 mL样品加入到100 yL 200 mmol L-1 EDC中反应10分钟。接着，加入10 yL碳量子点溶液 反应10分钟。然后用日立F-7000型荧光分光光度计记录荧光强度，选择激发波长360 nm，激 发光狭缝宽度为10 nm，记录荧光光谱，设置光电倍增管电压450 V，扫描速度1200 nm/ min，在380到600 nm的范围内扫描记录体系的荧光性质。最后根据测量的荧光强度带入标 准曲线计算得到的谷胱甘肽的平均浓度为10.2 μπιο? L-1，即其在自制化妆品的含量为 0.47%，回收率为94%。
[0034] 以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利 范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
【主权项】
1. 一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法，其特征在于，主要包括以下步骤： (1) 采用高温煅烧法制备碳量子点溶液； (2) 取不同浓度的谷胱甘肽与钝化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺混合5~30 min，接着加入碳量子点溶液中反应10~30 min，然后进行荧光分析； (3) 记录钝化后碳量子点溶液在360nm激发波长下的荧光光谱图，分析不同浓度谷胱甘 肽下钝化后碳量子点溶液荧光强度的变化。2. 根据权利要求1所述荧光分析方法，其特征在于，步骤（1)所述高温煅烧法制备碳量 子点溶液主要包括:在180~220°C马弗炉中对柠檬酸进行高温煅烧20~45 min，将得到的淡 黄色液体冷却至室温;再用碱性试剂溶解，将pH调至中性。3. 根据权利要求2所述荧光分析方法，其特征在于，所述碱性试剂为NaOH或者KOH。4. 根据权利要求1所述荧光分析方法，其特征在于，每10 yL 0.03~0.05 mg ml/1碳量 子点溶液，添加 100 yL 200 mmol L-1钝化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。5. 根据权利要求1所述荧光分析方法，其特征在于，所述荧光分析的条件为pH为7.0~ 7.8〇6. 根据权利要求5所述荧光分析方法，其特征在于，所述谷胱甘肽、所述1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基)碳二亚胺均用pH为7.0~7.8的10 mmol L-1 PBS缓冲溶液配制。7. 根据权利要求3所述荧光分析方法，其特征在于，所述NaOH或K0H的浓度为50~200 mg mL-、8. 根据权利要求1所述荧光分析方法，其特征在于，所述碳量子点的粒径分布为2.0~ 5.0 nm〇9. 根据权利要求1-8任一项所述荧光分析方法的应用，其特征在于，用于在血清、化妆 品或水果中检测谷胱甘肽。
【文档编号】G01N21/64GK106092984SQ201610396625
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日 公开号201610396625.3, CN 106092984 A, CN 106092984A, CN 201610396625, CN-A-106092984, CN106092984 A, CN106092984A, CN201610396625, CN201610396625.3
【发明人】杨建英, 潘家宏, 徐宁, 郑伟光, 韩飞, 姚庆伟
【申请人】广东省汕头市质量计量监督检测所