一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S的快速检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S快速检测的方法，包括如下步骤：步骤1、氮杂石墨烯量子点(NGQDs)溶液的制备；步骤2、银纳米粒子(AgNPs)分散液的制备；步骤3、氮杂石墨烯量子点?探针1(NGQDs?probe1)分散液的制备；步骤4、银纳米粒子?探针2(AgNPs?probe2)分散液的制备；步骤5、荧光共振能量转移传感器的构建；步骤6、对CaMV35S目标DNA进行检测，建立标准曲线。该传感器的制备是基于DNA互补配对杂交特异性作用所构建的，因而相对于免疫反应而言有与目标分子结合力强、特异性高、长时间暴露不容易变性、对周围环境要求低等特点。
【专利说明】
一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S的快速检测方法
技术领域
[0001]本发明属于荧光共振能量转移领域，特指一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S的快速检测方法。【背景技术】
[0002]转基因作物(Genetically Modified Organisms，简称GMOs)是指利用生物技术， 把从动物、植物或微生物等生物体中经鉴定、分离的目的基因插入植物基因组中，改变其遗传组成，产生新的农艺性状的植物。
[0003]目前转基因检测方法主要是基于外源蛋白靶标的检测、RNA的检测和基于核酸的检测。以外源蛋白为靶标的检测方法是基于抗体对抗原的特异性识别，主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫试纸条法和蛋白质芯片，但是这些方法背景信号高、蛋白质活性难以长久保持、开发特异性抗体的成本高、加工过的转基因产品其蛋白质发生变性而无法进行检测。基于RAN的检测收到RNA容易降解和对实验条件要求较高的限制，从而较难普及。而DNA 是相当稳定的分子，适合多数种类样品(原材料、食品配方组成成分、加工产品)的检测，因此，针对DNA的检测方法是目前最主要的GMOs检测法，它通过检测样品中是否含有外源基因成分来判断样品中是否含有转基因成分。目前GMOs所采用的启动子主要为来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子。针对CaMV35S的检测可满足大多数现有转基因植物检测的需要。
[0004]DNA检测法中，最常用的是聚合酶链式反应(PCR)。尽管PCR方法是高灵敏度的DNA 水平检测方法，但是常伴有各种假性结果出现:一方面，DNA提取时产生的各种反应抑制因子，可能使PCR呈假阴性；另一方面，PCR过程中容易引入非特异性扩增，从而使PCR呈假阳性。此外，PCR样品需要量大，操作繁琐，检测时间长，还容易造成定量不准确等一系列问题。 因此，发展一种非PCR扩增的快速检测方法成为GM0检测所追求的目标。
[0005]焚光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)是指两个基团在足够靠近时，供体分子受激发后从激发态的电子能态回落到基态时，能量向邻近的受体分子共振转移，该过程是一种非辐射形式的能量传递，需要满足的条件是:(1)两个基团足够接近，距离低于l〇nm; (2)供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。该技术结合纳米材料所构建的生物传感器，具有较高灵敏度和选择性。而量子点是一种新型荧光纳米材料，相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱窄而且不拖尾，因而，以量子点为给体的荧光共振能量转移，可减少给体与受体发射光谱的重叠;量子点的激发光谱范围较宽， 当它作为能量给体时，可以更自由地选择激发波长，从而最大限度地避免对受体的直接激发;量子点的发射光谱可调，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量给体。所以，量子点应用于荧光共振能量转移的研究，已受到广大科研工作者的广泛关注。其中，石墨烯量子点(GQDs)由于具有良好的化学惰性、生物相容性和较低的生物毒性，可取代传统的半导体量子点，在生物成像、疾病检测、药物输送和光电器件应用领域中引起了极大关注。而氮参杂是一种对石墨烯量子点性能调节非常有效的方法。与GQDs相比，氮参杂GQDs(NGQDs)中通过化学键合N原子后，其特征明显改变，并可提供更多的活性位点，且增强其荧光性能。NGQDs的最佳激发光谱在355nm，而荧光发射光谱位于435nm处，与银纳米粒子 (AgNPs)的紫外吸收光谱(405nm左右)有很大程度的重叠。NGQDs和AgNPs分别作为FRET传感器的能量供体和受体。信号探针DNA(pr〇bel)末端修饰氨基，与NGQDs的羧基通过酰胺反应， 形成NGQDs-probel;捕获探针DNA(probe2)末端修饰疏基，通过Ag-S键形成AgNPs_probe2; 在适当条件下，NGQDs-probel、AgNPs_probe2与待检测目标DNA(tDNA)通过完全杂交形成 “三明治”结构，拉进NGQDs和AgNPs的距离，引起荧共振能量转移，从而淬灭NGQDs的荧光。如果所检测序列与捕获探针DNA和信号探针DNA不能互不配对杂交，则无法形成“三明治”结构，故没有NGQDs的荧光淬灭效应产生。
【发明内容】
[0006]本发明旨在发明一种低毒、高灵敏度、高选择性、简单易操作等优点为一体的荧光共振能量转移传感器，提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的定量检测含有CaMV35S启动子转基因作物及产品的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低的难题。
[0007]—种简单的荧光共振能量转移传感器检测较低浓度GM0含量的方法:发出荧光信号的NGQDs通过酰胺反应和probe 1结合，而AgNPs通过Ag-S键的化学键合作用力链接上 probe2,因为NGQDs和AgNPs均有负电性，两者共同存在是，由于静电排斥作用不能结合，而有目标DNA出现是，目标DNA通过杂交互补配对原则，两端分别与probel和probe2结合，从而拉近了NGQDs和AgNPs的距离。而NGQDs的荧光发射光谱和AgNPs的紫外吸收光谱有40%的光谱重叠，由此引发NGQDs作为能量供体，AgNPs作为能量受体的荧光共振能量转移，发生荧光猝灭，通过荧光猝灭率和CaMV35S启动子浓度绘制标准曲线，以达到对转基因实际样品中 CaMV35S启动子检测的目的。
[0008]本发明是通过如下技术方案实现的:
[0009]一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S的快速检测方法，包括如下步骤:[0〇1〇]步骤1、氮杂石墨稀量子点(NGQDs)溶液的制备
[0011]步骤2、银纳米粒子(AgNPs)分散液的制备[〇〇12]步骤3、氮杂石墨烯量子点-探针1 (NGQDs-probel)分散液的制备[0〇13]取步骤1制备的氮杂石墨烯量子点溶液超声分散，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，振荡均匀，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，振荡均匀，加入探针1储备液;在室温下反应，得到氮杂石墨烯量子点-探针1，记作NGQDs-probel，之后用乙醇洗涤，离心，最后将NGQDs-probel分散于Tris-HCl缓冲液中，得到NGQDs-probel分散液，备用；[0〇14] 步骤4、银纳米粒子-探针2 (AgNPs-probe 2)分散液的制备
[0015]将探针2储备液加入到步骤2得到的银纳米粒子分散液中室温孵育，振荡反应，然后加入Tris-HCl缓冲液，再加入NaCl溶液调节钠离子浓度，振荡反应;反应结束后，水洗、离心，得到银纳米粒子-探针2，记作AgNPs-probe2，将全部产物Ag-probe2分散在Tr is-HCl缓冲液中得到Ag-probe2分散液，备用；
[0016]步骤5、荧光共振能量转移传感器的构建[〇〇17] 将CaMV35S目标DNA储备液加入到步骤3制备的NGQDs-probel溶液中，恒温振荡孵育，再加入步骤4制备的Ag-probe2分散液，加入NaCl溶液调节钠离子浓度，之后持续孵育， 最后形成NGQDs-pr〇bel/tDNA/Ag-pr〇be2的三明治夹心结构，得到荧光共振能量转移传感器；[〇〇18] 步骤6、对CaMV35S目标DNA进行检测，建立标准曲线:[〇〇19] 将CaMV35S目标DNA溶液加入到制备好的NGQDs-probel分散液中，恒温振荡孵育， 再加入制备好的Ag-pr〇be2分散液，加入NaCl溶液调节钠离子浓度，之后持续孵育，从而形成NGQDs-pr〇bel/tDNA/Ag-pr〇be2的三明治夹心结构，采用荧光分光光度计在355nm下测量溶液的荧光强度，并建立荧光淬灭效率与tDNA的标准曲线。
[0020]步骤3中，所使用的氮杂石墨烯量子点溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液与入探针1储备液的体积比为42:2:2:1， 所使用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液的浓度为400mM，所使用的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液的浓度为200mM，所使用的探针1储备液的浓度为1 OOyM;所述的在室温下反应的时间为40mi n;所使用的Tr i s-HC 1缓冲溶液浓度为1 OmM，pH=8.0，所使用的Tris-HCl缓冲溶液与所使用的氮杂石墨烯量子点溶液的体积比为47:42。
[0021]步骤4中，所使用的探针2储备液、银纳米粒子分散液、Tris-HCl缓冲液的体积比为 9:200:25;所使用的探针2储备液的浓度为100mM，所使用的Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM， pH=8.0，Tris-HCl缓冲液与所使用的银纳米粒子分散液的体积比为5:1;所使用的NaCl溶液的浓度为6M，调节钠离子浓度为2M。[〇〇22] 步骤5中，所使用的CaMV35S目标DNA储备液、NGQDs-probel分散液与Ag-probe2分散液的体积比为5: 21: 50，所使用的CaMV35S目标DNA储备液浓度为100mM，恒温振荡孵育的时间为40min，持续孵育的时间为2h;所使用的NaCl溶液的浓度为6M，调节钠离子浓度为2M。 [〇〇23] 步骤6中，所使用的CaMV35S目标DNA溶液、NGQDs-probel分散液与Ag-probe2分散液的体积比为5:21:50，所使用的CaMV35S目标DNA溶液的浓度为0.1?500nM;所述的恒温振荡孵育的时间为40min，持续孵育的时间为2h;所使用的NaCl溶液的浓度为6M，调节钠离子浓度为2M。[〇〇24] 所用的DNA序列如下:
[0025]3’-氨基修饰的探针(probel):GAT GCC TCT GCC-NH2
[0026]5’-巯基修饰的探针(probe2):HS-G GCC ATC GIT GAA
[0027]CaMV35S 目标DNA:GGC AGA GGC ATC TTC AAC GAT GGC C
[0028]所述的AgNPs粒径为12nm左右。[〇〇29] 所述的NGQDs的粒径为5nm左右。[〇〇3〇]所述的3 氨基修饰的探针与CaMV35S目标DNA前半段部分碱基互补配对，其氨基与NGQDs发生酰胺反应连接到NGQDs上。[〇〇31]所述的5 ’ -巯基修饰的探针与CaMV35S目标DNA后半段部分碱基互补配对，其巯基与AgNPs通过Ag-S共价结合，连接到AgNPs上。[〇〇32]所述的标准曲线是指传感器与不同浓度的CaMV35S目标DNA作用，发生荧光共振能量转移之后，所测得的荧光信号。根据各个浓度对应的荧光猝灭效率绘制的标准曲线。
[0033] 有益效果:[〇〇34]本发明基于DNA互补配对杂交的特异性作用，采用荧光共振能量转移传感器的制备方法，建立了一种荧光共振能量转移传感器检测CaMV35S目标DNA的方法，为转基因作物中CaMV35S启动子的检测提供了一种新的方法途径。该方法较目前CaMV35S启动子检测方法，具有如下优点:
[0035](1)该传感器的制备是基于DNA互补配对杂交特异性作用所构建的，因而相对于免疫反应而言有与目标分子结合力强、特异性高、长时间暴露不容易变性、对周围环境要求不尚等特点。[〇〇36](2)传感器构建的设计思路清晰，采用NGQDs为能量供体，AgNPs为能量受体构建了荧光共振能量转移传感器。
[0037](3)该方法所有试剂具有无毒，低价，合成方法简单等优点，相对于其他方法成本降低很多。
[0038](4)该方法具有荧光共振能量转移传感器所具有的操作简便灵活、分析速度快的特点，适用于快速检测分析。【附图说明】[〇〇39] 图1为检测不同浓度CaMV35S目标DNA的标准曲线图，其中曲线a?k表示CaMV35S目标 DNA 的浓度依次为0，0 ? 1，0 ? 5，1，5，10，50，100，200，400，500nM。【具体实施方式】
[0040]下面结合具体实施例对本发明作进一步描述:[0041 ]本发明在配置探针1储备液、探针2储备液以及CaMV35S目标DNA溶液时，所使用的溶剂均为Tris-HCl缓冲液，浓度为10mM，pH=8.0。[〇〇42] 实施例1:
[0043] (l)NGQDs的制备[〇〇44]采用现有的常压下热裂解法一步制备氮杂石墨烯量子点(NGQDs )，0.5g柠檬酸铵和15mL水混合后，转入三颈烧瓶中，将三颈烧瓶置于200 °C油浴锅中加热，三颈烧瓶上接有球形冷凝管，冷凝管出气口绑有气球，以确保整个过程在相对密闭、恒压的环境中进行。随着加热反应的进行，气球开始微微膨胀，说明有氨气、H20等气体生成，通过冷凝回流，所生成的氨气又以NH4+的形式重新回到溶液中，溶液的颜色也由无色渐渐变成淡黄色。随着加热时间的推移，气球逐渐胀大，在持续加热l〇min后，气球的直径稳定在5?7cm左右。反应 20min左右，膨胀的气球开始收缩，体积减小，溶液颜色也由淡黄色不断加深至黄色。在反应达到0.5h时，气球直径收缩至4?5cm，而此时溶液呈现淡黄褐色，说明NGQDs成功合成。最后，用Na0H(10mg mL—1)逐滴加到NGQDs中，调节溶液pH至8.0，于4°C下冷藏保存，得到NGQDs 溶液，备用。[〇〇45] (2)AgNPs分散液的制备
[0046]采用现有的方法制备:将圆底烧瓶置于冰水浴中，加入磁力搅拌子，首先在圆底烧瓶中加入20ml (3mM)硼氢化钠和2ml (质量分数5 % )聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，磁力搅拌5分钟， 之后逐滴加入10mL(2mM)的硝酸银溶液，之后持续反应60min，待溶液颜色由无色变成橙黄色之后，撤除冰水浴，持续搅拌至室温，把反应生成物离心洗涤后，全部超声分散于5mL蒸馏水中。
[0047](3) NGQDs-probe 1 分散液的制备[〇〇48] 取420yL NGQDs溶液超声分散15分钟后，加入20yL 400mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，振荡2分钟后，加入20yL 200mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)， 继续振荡20分钟。加入10yL 100處probel在室温下反应40分钟，得到NGQDs-probel之后用乙醇洗涤离心，最后分散于470yL的10mM Tris_HCl(pH8.0)缓冲液中，得到NGQDs-probe]^散液。
[0049](4) AgNPs-probe 2 分散液的制备[〇〇5〇] 将45yL probe2储备液(100mM)加入到lmL AgNPs分散液中室温孵育、振荡24h，然后加入125yL 10mM Tris-HCl(pH8.0)，同时加入6M NaCl溶液调节钠离子浓度至2M，继续振荡24h，反应结束后，水洗、离心若干次，将产物(Ag-probe2)重新分散在5mL Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)中，得到AgNPs-probe2分散液。
[0051](5)荧光共振能量转移传感器的构建
[0052]将1〇〇此CaMV35S目标DNA( tDNA) (100mM)储备液加入到420此制备好的NGQDs-probel中，恒温振荡孵育40min后，加入lmL制备好的Ag-probe2溶液，加入6M NaCl调节钠离子浓度至2M，之后持续孵育2小时，以形成NGQDs-probel/tDNA/Ag-probe2的三明治夹心结构，从而引起NGQDs到AgNPs的荧光能量共振转移。[0053 ](6)对CaMV35S启动子进行检测，建立标准曲线:
[0054]将浓度分别为0 ? 1，0 ? 5，1，5，10，50，100，200，400，500nM的 CaMV35S 目标 DNA( tDNA) 溶液各1〇〇此加入到420此制备好的NGQDs-probel分散液中，恒温振荡孵育40min后，加入 lmL制备好的Ag-probe2分散液，加入6M NaCl调节钠离子浓度至2M，之后持续孵育2小时，从而形成NGQDs-probe l/tDNA/Ag-probe2的三明治夹心结构，引发NGQDs到AgNPs的焚光能量共振转移，导致NGQDs的荧光淬灭，采用荧光分光光度计在355nm测量溶液的荧光强度，并建立荧光淬灭效率与tDNA的标准曲线，整个荧光共振能量转移传感器对CaMV35S启动子的检测过程如图1所示，其中曲线a为不存在CaMV35S目标DNA情况，作为空白对比。[〇〇55]实施例2:[〇〇56]荧光共振能量转移传感器对CaMV35S目标DNA的标准曲线绘制
[0057]将l〇〇yL浓度分别为0 ? 1，0 ? 5，1，5，10，50，100，200，400，500nM的CaMV35S 目标DNA 加入到420yL制备好的NGQDs-probel中，恒温振荡孵育40min后，加入lmL制备好的Ag-probe2溶液，加入NaCl调节钠离子浓度至2M，之后持续孵育2小时，从而形成NGQDs-probel/ tDNA/Ag-probe2的三明治夹心结构，引发NGQDs到AgNPs的荧光能量共振转移，导致NGQDs的荧光淬灭，采用荧光分光光度计在355nm测量溶液的荧光强度，并建立荧光淬灭效率与 CaMV35S目标DNA的标准曲线。[〇〇58]实施例3:
[0059]荧光共振能量转移传感器对不同含量转基因大豆的实际样品的检测:
[0060]将100yL含有0.5%，1%，10%转基因大豆的DNA提取物的PCR扩增产物加入到420y L制备好的NGQDs-probel中，恒温振荡孵育40min后，加入lmL制备好的Ag-probe2溶液，加入 NaCl调节钠离子浓度至2M，之后持续孵育2小时，从而形成NGQDs-probel/tDNA/Ag-probe2的三明治夹心结构，引发NGQDs到AgNPs的荧光能量共振转移，导致NGQDs的荧光淬灭，采用荧光分光光度计在355nm测量溶液的荧光强度，猝灭效率与标准曲线进行对比，得出是否含有CaMV35S启动子的结论。
【主权项】
1.一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S的快速检测方法，其特征在于，包 括如下步骤:步骤1、氮杂石墨烯量子点溶液的制备步骤2、银纳米粒子分散液的制备步骤3、氮杂石墨烯量子点-探针1分散液的制备取步骤1制备的氮杂石墨烯量子点溶液超声分散，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐溶液，振荡均匀，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液，振荡均匀，加入探针1储备液； 在室温下反应，得到氮杂石墨烯量子点-探针1，记作NGQDs-probel，之后用乙醇洗涤，离心， 最后将NGQDs-probel分散于Tris-HCl缓冲液中，得到NGQDs-probel分散液，备用；步骤4、银纳米粒子-探针2分散液的制备将探针2储备液加入到步骤2得到的银纳米粒子分散液中室温孵育，振荡反应，然后加 入Tris-HCl缓冲液，再加入NaCl溶液调节钠离子浓度，振荡反应;反应结束后，水洗、离心， 得到银纳米粒子-探针2，记作AgNPs-probe2，将全部产物Ag-probe2分散在Tris-HCl缓冲液 中得到Ag-probe2分散液，备用；步骤5、荧光共振能量转移传感器的构建将CaMV35S目标DNA储备液加入到步骤3制备的NGQDs-probel溶液中，恒温振荡孵育，再 加入步骤4制备的Ag-probe2分散液，加入NaCl溶液调节钠离子浓度，之后持续孵育，最后形 成NGQDs-pr〇bel/tDNA/Ag-pr〇be2的三明治夹心结构，得到荧光共振能量转移传感器；步骤6、对CaMV35S目标DNA进行检测，建立标准曲线将CaMV35S目标DNA溶液加入到制备好的NGQDs-probel分散液中，恒温振荡孵育，再加 入制备好的Ag-pr〇be2分散液，加入NaCl溶液调节钠离子浓度，之后持续孵育，从而形成 NGQDs-pr〇bel/tDNA/Ag-pr〇be2的三明治夹心结构，采用荧光分光光度计在355nm下测量溶 液的荧光强度，并建立荧光淬灭效率与tDNA的标准曲线。2.根据权利要求1所述的一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S的快速检 测方法，其特征在于，步骤3中，所使用的氮杂石墨烯量子点溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液与入探针1储备液的体积比 为42: 2: 2:1，所使用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液的浓度为 400mM，所使用的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液的浓度为200mM，所使用的探针1储备液的浓 度为100yM;所述的在室温下反应的时间为40min;所使用的Tris-HCl缓冲溶液浓度为10mM， pH = 8.0,所使用的Tris-HCl缓冲溶液与所使用的氮杂石墨烯量子点溶液的体积比为47: 42 〇3.根据权利要求1所述的一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S的快速检 测方法，其特征在于，步骤4中，所使用的探针2储备液、银纳米粒子分散液、Tris-HCl缓冲液 的体积比为9:200:25;所使用的探针2储备液的浓度为100mM，所使用的Tris-HCl缓冲液的 浓度为10mM，pH=8.0，Tris-HCl缓冲液与所使用的银纳米粒子分散液的体积比为5:1;所使 用的NaCl溶液的浓度为6M，调节钠离子浓度为2M。4.根据权利要求1所述的一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S的快速检 测方法，其特征在于，步骤5中，所使用的CaMV35S目标DNA储备液、NGQDs-probel分散液与 Ag-probe2分散液的体积比为5:21:50，所使用的CaMV35S目标DNA储备液浓度为100mM，恒温振荡孵育的时间为40min，持续孵育的时间为2h;所使用的NaCl溶液的浓度为6M，调节钠离 子浓度为2M。5.根据权利要求1所述的一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S的快速检 测方法，其特征在于，步骤6中，所使用的CaMV35S目标DNA溶液、NGQDs-probel分散液与Ag-probe2分散液的体积比为5: 21:50，所使用的CaMV35S目标DNA溶液的浓度为0.1?500nM;所 述的恒温振荡孵育的时间为40min，持续孵育的时间为2h;所使用的NaCl溶液的浓度为6M， 调节钠离子浓度为2M。6.根据权利要求1所述的一种荧光共振能量转移传感器的制备及对CaMV35S的快速检 测方法，其特征在于，所用的探针1:GAT GCC TCT GCC-NH2,探针2:HS-G GCC ATC GIT GAA， CaMV35S目标DNA:GGC AGA GGC ATC TTC AAC GAT GGC C。
【文档编号】G01N21/64GK106092978SQ201610367730
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】李雅琪, 王坤, 蔡健荣, 孙力
【申请人】江苏大学