利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，用Stober法，把标记一种荧光素的蛋白A包裹进纳米颗粒，再将上述包裹好蛋白A的颗粒与标记另一种荧光素的蛋白B吸附结合。调节纳米颗粒的尺寸，根据FRET发生的作用条件，使包裹的蛋白A与纳米颗粒表面吸附的第一层蛋白B保持在10 nm之内，利用FRET效果强弱来探测来纳米颗粒与蛋白质相互作用后形成纳米颗粒?蛋白冠中硬壳部分的过程。本发明利用纳米颗粒包裹蛋白、结合FRET技术准确探测纳米颗粒与吸附在表面的第一层蛋白的相互作用。能方便地探测备纳米颗粒大小、表面功能化、蛋白表面电荷等因素对蛋白质与纳米颗粒相互作用的影响。
【专利说明】
利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种蛋白质与纳米颗粒的相互作用机制的检测分析方法，特别是涉及一种纳米颗粒诱导吸附在其表面的蛋白质发生结构和生物学效应的检测分析方法，应用于纳米材料生物医学应用及其生物安全性研究技术领域。
【背景技术】
[0002]研究蛋白质与纳米颗粒的相互作用机制已经成为当今重要的前沿研究领域。纳米颗粒进入人体之后，可以与人体中不同蛋白质反应。蛋白吸附在纳米颗粒表面，形成被称为蛋白质冠的包裹层，其结构包含硬壳(hard corona)和软壳(soft corona)。其中硬壳(hardcorona)部分较为稳定，不会有大量的吸附和解吸附变化。而软壳(soft corona)会因为接触外部蛋白种类不同而随时发生可逆地吸附和解吸附。纳米颗粒-蛋白冠的组成和它的厚度取决于纳米颗粒和蛋白质的物理化学性质。在人体内，纳米颗粒和蛋白质的相互作用是一个动态过程。值得注意的是，纳米材料生物医学应用及其生物安全性评估的关键问题便是纳米颗粒吸附蛋白形成蛋白冠后的生物学效应。
[0003]目前来说，已经有许多研究证明了纳米颗粒会诱导吸附在其表面的蛋白质发生结构和生物学效应的改变。有报道称，纳米颗粒可能会加速蛋白质和多肽的纤维化，从而引起一些疾病，比如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)。纳米颗粒会因为吸附在其表面的蛋白影响而发生物理化学性质改变，比如纳米颗粒的溶解度、分散性和表面电荷等。更重要的是，纳米颗粒-蛋白冠的生物学效应与纳米颗粒本身或蛋白本身单独存在时的生物学效应不尽相同。比如，氧化石墨烯(G0，100 - 500 nm)和血清蛋白的尺寸都比毛细血管的直径小的多。因此，它们本身都不会被肺部的毛细血管所截留。但是，当它们发生了相互作用之后会形成较大的聚合体，GO和蛋白的聚合体就会被毛细血管截留，从而留在肺部。纳米颗粒与蛋白结合后的聚合体的生物学效应更应引起我们的足够重视。
[0004]现有关于纳米颗粒和表面吸附蛋白的相互作用研究没有办法将蛋白冠的软壳、硬壳部分加以区分，研究方法有限，且大多都是定态分析，而纳米颗粒进入人体后与蛋白质的相互作用是动态的过程。综上所述，深入了解纳米颗粒与蛋白的相互作用机制、以及形成蛋白冠的过程，对于纳米颗粒的生物应用以及生物安全性至关重要，成为亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，能对纳米颗粒与蛋白质的相互作用动态过程进行动态定量研究分析，具体利用纳米颗粒包裹蛋白、结合FRET技术准确探测纳米颗粒与吸附在表面的第一层蛋白的相互作用，极大地拓宽了相互作用的研究范围。
[0006]为达到上述发明创造目的，本发明采用下述技术方案:
一种利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，包括如下步骤:利用Stober法，将具有一种荧光素标记的蛋白A对纳米颗粒进行包裹，形成纳米颗粒包裹体，再将包裹好蛋白A的纳米颗粒包裹体与具有另一种荧光素标记的蛋白B进行吸附结合，形成纳米颗粒-蛋白冠结合体，并通过调节纳米颗粒的尺寸，使纳米颗粒的蛋白A包裹层与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B结合层的距离保持在10 nm之内，再以两种荧光素分别作为荧光发射供体，利用荧光发射供体的激发波长分别去激发纳米颗粒包裹体的荧光素或纳米颗粒-蛋白冠结合体的荧光素，利用FRET检测方法，通过FRET检测效果的强弱来探测纳米颗粒与蛋白质相互作用及形成硬蛋白冠的过程参数。
[0007]作为本发明优选的技术方案，本发明利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，将具有FITC标记的蛋白A对纳米颗粒进行包裹，形成纳米颗粒包裹体，再将包裹好蛋白A的纳米颗粒包裹体与具有TRITC标记的蛋白B进行吸附结合，形成纳米颗粒-蛋白冠结合体，并通过调节纳米颗粒的尺寸，FRET发生的作用条件，使纳米颗粒的蛋白A包裹层与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B结合层的距离保持在10 nm之内，再以FITC和TRITC分别作为荧光发射供体，利用荧光发射供体的激发波长分别去激发纳米颗粒包裹体的FITC或纳米颗粒-蛋白冠结合体的TRITC，利用FRET检测方法，通过FRET检测效果的强弱来探测纳米颗粒与蛋白质相互作用及形成硬蛋白冠的过程参数。本发明方法的优点是包裹的蛋白A只与纳米颗粒表面吸附的形成hard corona的第一层蛋白B发生FRET，而不与吸附的形成soft corona的第二层蛋白B发生FRET效应，可以准确地探测纳米颗粒与吸附在表面的第一层蛋白的相互作用。此外，利用本发明方法可以方便地探测备纳米二氧化硅颗粒的大小、表面功能化、蛋白表面电荷等因素对蛋白质与纳米颗粒相互作用的影响。结合停流技术还可以实现纳米粒子与蛋白质分子毫秒级的快速混合，并进一步揭示纳米粒子与蛋白质直接相互作用的快速动力学过程。
[0008]作为上述方案的进一步优选技术方案，利用FRET检测方法，通过FRET检测效果来探测纳米颗粒与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B的相互作用参数。
[0009]作为上述方案的进一步优选技术方案，利用FRET检测方法，检测纳米颗粒的尺寸大小、纳米颗粒表面功能化参数和蛋白表面电荷参数中任意一种参数或任意几种参数的组合作为因素，对纳米颗粒与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B的相互作用参数的影响。
[0010]
作为上述方案的进一步优选技术方案，上述纳米颗粒与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B的相互作用参数或所述纳米颗粒表面功能化参数优选包括表面电荷电量、蛋白尺寸和蛋白等电点。
[0011]作为上述方案的进一步优选技术方案，上述蛋白表面电荷参数优选包括纳米颗粒包裹体的蛋白A表层电荷电量、蛋白尺寸和蛋白等电点以及纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B表面电荷电量、蛋白尺寸和蛋白等电点。
[0012]作为上述方案的进一步优选技术方案，优选结合停流方法，对纳米颗粒包裹体与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B分子发生毫秒级的快速混合过程的动力学参数进行检测。
[0013]作为上述方案的进一步优选技术方案，上述纳米颗粒的成分优选为二氧化娃、二氧化钛、氧化镁、氧化铝或金纳米颗粒。作为上述方案的进一步优选技术方案，通过调节纳米颗粒的尺寸，使纳米颗粒的蛋白A包裹层与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B结合层的距离保持在5?10 nm之内。
[0014]本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点:
1.本发明方法的优点是包裹的蛋白A只与纳米颗粒表面吸附的第一层蛋白B(形成hardcorona)发生FRET，而不与吸附的第二层蛋白B(形成soft corona)发生FRET，可以准确地探测纳米颗粒与第一层吸附蛋白的相互作用；
2.本发明方法的纳米二氧化硅的尺寸易于控制，根据FRET强弱调整蛋白冠的软壳和硬壳的厚度较为容易，纳米二氧化硅表面易于功能化，外部游离蛋白的选择性多样，改变影响纳米颗粒与表面第一层吸附蛋白相互作用的条件较为容易，极大地拓宽了相互作用的研究范围；
3.本发明利用FRET效果的强弱来探测来纳米颗粒与蛋白质相互作用及形成硬蛋白冠的过程;此外，利用本发明方法可以方便地探测备纳米二氧化硅颗粒的大小、表面功能化、蛋白表面电荷等因素对蛋白质与纳米颗粒相互作用的影响，结合停流技术还可以实现纳米粒子与蛋白质分子毫秒级的快速混合，并进一步揭示纳米粒子与蛋白质直接相互作用的快速动力学过程。
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例一包裹溶菌酶(标记FITC)的纳米二氧化硅与蛋白相互作用流程图。
[0016]图2为本发明实施例一包裹溶菌酶(标记FITC)的纳米二氧化硅的不同分辨率TEM图。
[0017]图3为本发明实施例一包裹溶菌酶(标记FITC)的纳米二氧化硅的不同分辨率HRTEM图 ο
[0018]图4为本发明实施例一纳米颗粒和蛋白质相互作用前后的荧光发射谱图。
[0019]图5为本发明实施例一纳米颗粒和蛋白质按不同摩尔浓度比相互作用的发射谱图。
【具体实施方式】
[0020]本发明的优选实施例详述如下:
实施例一:
在本实施例中，参见图1?图5，一种利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程的方法，包括如下步骤:
a.采用溶菌酶作为蛋白A，采用牛血清白蛋白作为蛋白B，先将上述蛋白透析、脱盐，然后将各蛋白按一定浓度分别溶于碳酸钠缓冲溶液里，分别制成溶菌酶缓冲溶液和牛血清白蛋白缓冲溶液。将两种荧光素FITC(异硫氰酸荧光素)和TRITC(四甲基罗丹明)分别溶于DMSO，分别制成异硫氰酸荧光素DMSO溶液和四甲基罗丹明荧光素DMSO溶液;逐滴将上述荧光素DMSO溶液对应滴入蛋白的碳酸钠缓冲溶液里，即在溶菌酶缓冲溶液中滴加异硫氰酸荧光素DMSO溶液，在牛血清白蛋白缓冲溶液中滴加四甲基罗丹明荧光素DMSO溶液，分别剧烈搅拌反应，最后用G-25柱过柱脱盐，除去游离的荧光素，制成具有FITC标记的质量浓度为2mg/mL的荧光蛋白A溶液和具有TRITC标记的量浓度为2mg/mL的荧光蛋白B溶液，备用；
b.然后将(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)与在步骤a中制备的标记好的荧光蛋白A溶液搅拌反应完全，再加入适量的氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)并搅拌反应过夜，得到接好APTS的荧光蛋白A溶液；
c.再将正娃酸乙酯(TE0S)与环己烧(cyclohexane)按5:4的质量比例配制正娃酸乙酯与环己烷得混合溶液，备用；
d.取适量的精氨酸(Arg)溶于去离子水中后，制成质量浓度为5mg/mL精氨酸溶液，将精氨酸溶液装入茄型瓶，搅拌，向精氨酸溶液中加入在步骤b中制备的APTS的荧光蛋白A溶液，在常温剧烈搅拌，再按照I次/30 min的频率加入微量TEOS和环己烷的混合溶液，在加入三次在步骤c中制备的TEOS和环己烷的混合溶液后，进行反应12 h;然后在用水超滤洗涤产物三次后，通过浓缩后，得到尺寸为7-20 nm的包裹荧光标记后溶菌酶的纳米二氧化硅，使纳米颗粒的蛋白A包裹层与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B结合层的距离保持在10nm之内，参见图2和图3，本实施例通过改进后的Stober法，将具有FITC标记的蛋白A对二氧化娃纳米颗粒进行包裹，形成二氧化娃纳米颗粒包裹体，得到含有二氧化娃纳米颗粒包裹体的溶液；
e.使在步骤d中制备的含有二氧化硅纳米颗粒包裹体的溶液与在步骤a中制备的标记好的荧光蛋白B溶液混合，具体为将包裹荧光标记后溶菌酶的纳米二氧化硅和牛血清白蛋白按适当比例混合，并加入PBS缓冲液，混合均匀，可得到吸附单一蛋白的纳米颗粒，本实施例将包裹好蛋白A的二氧化硅纳米颗粒包裹体与具有TRITC标记的蛋白B进行吸附结合，形成纳米颗粒-蛋白冠结合体。
[0021]f.通过在步骤b中调节二氧化娃纳米颗粒的尺寸，参见图2和图3，使二氧化娃纳米颗粒的蛋白A包裹层与二氧化硅纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B结合层的总厚度保持在10 nm之内，再以FITC和TRITC分别作为荧光发射供体，利用荧光发射供体的激发波长分别去激发二氧化硅纳米颗粒包裹体的FITC或纳米颗粒-蛋白冠结合体的TRITC，利用FRET效果的强弱来探测二氧化硅纳米颗粒与蛋白质相互作用及形成硬蛋白冠的过程参数。
[0022]在本实施例中，参见图4和图5中，本实施例采用的二氧化硅纳米颗粒表面吸附蛋白质后，用450 nm的激发光去激发聚合体，520 nm处的发射峰是供体FITC本身的发射峰，如果发生FRET现象，则此处的发射峰会下降。580 nm处的发射峰是受体TRITC的发射峰，如果发生FRET现象则此处的发射峰会上升。相应的，如果聚合后再加入不标记荧光素的其他蛋白，可以将标记的TRITC的牛血清蛋白从纳米颗粒表面取代下来，520 nm处的峰会回升而580 nm的峰会下降。本实施例方法能检测包裹FITC标记后溶菌酶的纳米二氧化硅与牛血清白蛋白(标记TRITC)相互作用，并分析研究在不同时间加入不标记的蛋白可以确定纳米颗粒表面形成的硬蛋白冠的动力学过程。
[0023]参见图1，本实施例用改进后的Stober法把蛋白A(FITC标记)包裹进二氧化硅纳米颗粒，再将上述包裹好蛋白A的二氧化娃颗粒与蛋白B( TRI TC标记)吸附结合。调节二氧化娃纳米颗粒的尺寸使包裹的蛋白A与纳米颗粒表面吸附的第一层蛋白B保持在10 nm(FRET发生的作用条件)之内，参见图2和图3。再用供体的激发波长去激发结合体，利用FRET效果的强弱来探测纳米颗粒与表面吸附的第一层蛋白的相互作用及形成硬蛋白冠的。
[0024]纳米颗粒进入生物体后，马上和各种蛋白质碰撞、吸附，很快在表面形成各种蛋白质组成的一层包裹，被称为蛋白冠(protein corona)。其中紧挨纳米粒子的紧密蛋白质层又称为硬蛋白冠，外面一层松散的蛋白质称为软蛋白冠。本实施例方法的优点是利用纳米颗粒包裹蛋白、结合FRET技术准确探测纳米颗粒与吸附在表面的第一层蛋白的相互作用，以及纳米颗粒与蛋白质相互作用后形成纳米颗粒-蛋白冠中硬壳(hard corona)部分的过程。利用本实施例方法可以方便地探测备纳米二氧化硅颗粒的大小、表面功能化、蛋白表面电荷等因素对蛋白质与纳米颗粒相互作用的影响。结合停流技术还可以实现纳米粒子与蛋白质分子毫秒级的快速混合，并进一步揭示纳米粒子与蛋白质直接相互作用的快速动力学过程。
[0025]实施例二:
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于:
在本实施例中，一种利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程的方法，包括如下步骤:采用青色荧光蛋白(CFP)作为蛋白A，采用黄色荧光蛋白(YFP)作为蛋白B，分别制成青色荧光蛋白溶液和黄色荧光蛋白溶液，备用；用改进后的Stober法，制得包裹CFP的二氧化硅纳米颗粒，吸附适当比例的YFP XFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。控制包裹的CFP荧光供体蛋白与第一层吸附的YFP荧光受体蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，通过测量CFP荧光强度的损失量来探测二氧化硅纳米颗粒与第一层吸附的YFP蛋白的直接相互作用。本实施例将具有CFP对纳米颗粒进行包裹，形成纳米颗粒包裹体，再将包裹好CFP的纳米颗粒包裹体与YFP进行吸附结合，形成纳米颗粒-蛋白冠结合体，并通过调节纳米颗粒的尺寸，使纳米颗粒的CFP包裹层与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层YFP结合层的总厚度保持在5-10 nm之内，再以CFP和YFP分别作为荧光发射供体，利用荧光发射供体的激发波长分别去激发纳米颗粒包裹体的CFP或纳米颗粒-蛋白冠结合体的YFP，利用FRET检测方法，通过FRET检测效果的强弱来探测纳米颗粒与蛋白质相互作用及形成硬蛋白冠的过程参数，能够检测包裹青色荧光蛋白(CFP)的二氧化硅纳米颗粒与黄色荧光蛋白(YFP)的相互作用。
[0026]上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，其特征在于，包括如下步骤:利用Stober法，将具有一种荧光素标记的蛋白A对纳米颗粒进行包裹，形成纳米颗粒包裹体，再将包裹好蛋白A的纳米颗粒包裹体与具有另一种荧光素标记的蛋白B进行吸附结合，形成纳米颗粒-蛋白冠结合体，并通过调节纳米颗粒的尺寸，使纳米颗粒的蛋白A包裹层与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B结合层的距离保持在10nm之内，再以两种荧光素分别作为荧光发射供体，利用荧光发射供体的激发波长分别去激发纳米颗粒包裹体的荧光素或纳米颗粒-蛋白冠结合体的荧光素，利用FRET检测方法，通过FRET检测效果的强弱来探测纳米颗粒与蛋白质相互作用及形成硬蛋白冠的过程参数。2.根据权利要求1所述利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，其特征在于，包括如下步骤:将具有FITC标记的蛋白A对纳米颗粒进行包裹，形成纳米颗粒包裹体，再将包裹好蛋白A的纳米颗粒包裹体与具有TRITC标记的蛋白B进行吸附结合，形成纳米颗粒-蛋白冠结合体，并通过调节纳米颗粒的尺寸，使纳米颗粒的蛋白A包裹层与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B结合层的距离保持在10 nm之内，再以FITC和TRITC分别作为荧光发射供体，利用荧光发射供体的激发波长分别去激发纳米颗粒包裹体的FITC或纳米颗粒-蛋白冠结合体的TRITC，利用FRET检测方法，通过FRET检测效果的强弱来探测纳米颗粒与蛋白质相互作用及形成硬蛋白冠的过程参数。3.根据权利要求2所述利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，其特征在于:利用FRET检测方法，通过FRET检测效果来探测纳米颗粒与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B的相互作用参数。4.根据权利要求3所述利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，其特征在于:利用FRET检测方法，检测纳米颗粒的尺寸大小、纳米颗粒表面功能化参数和蛋白表面电荷参数中任意一种参数或任意几种参数的组合作为因素，对纳米颗粒与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B的相互作用参数的影响。5.根据权利要求3所述利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，其特征在于:所述纳米颗粒与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B的相互作用参数、或所述纳米颗粒表面功能化参数包括表面电荷电量、蛋白尺寸和蛋白等电点。6.根据权利要求5所述利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，其特征在于:所述蛋白表面电荷参数包括纳米颗粒包裹体的蛋白A表层电荷电量、蛋白尺寸和蛋白等电点以及纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B表面电荷电量表面电荷电量、蛋白尺寸和蛋白等电点。7.根据权利要求1?6中任意一项所述利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，其特征在于:结合停流方法，对纳米颗粒包裹体与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B分子发生毫秒级的快速混合过程的动力学参数进行检测。8.根据权利要求1?6中任意一项所述利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，其特征在于:所述纳米颗粒的成分为二氧化硅、二氧化钛、氧化镁或氧化铝或金纳米颗粒。9.根据权利要求1?6中任意一项所述利用荧光共振能量转移技术检测纳米颗粒表面硬蛋白冠形成过程参数的方法，其特征在于:通过调节纳米颗粒的尺寸，使纳米颗粒的蛋白A包裹层与纳米颗粒包裹体表面吸附的第一层蛋白B结合层的距离保持在5?10 nm之内。
【文档编号】G01N21/64GK105928919SQ201610295348
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】曹傲能, 王泽洋, 刘奕, 王海芳, 奚文松
【申请人】上海大学