专利名称：荧光共振能量转移类寡核苷酸基因芯片制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新的基因芯片制备方法，尤其涉及一种荧光共振能量转移类寡核苷酸基因芯片制备方法，可以用于核酸序列分析，属于生物信息工程技术领域。
为实现这样的目的，在本发明中，寡核苷酸片段(即基因探针)两端预先用相应的荧光基团标记，一个是荧光供体基团，另一个是荧光受体基团，片段的中间用生物素标记，荧光标记的寡核苷酸片段以微点阵的形式固定于streptavidin包被的玻片表面，制备基因芯片；基因芯片的寡核苷酸片段与待测核酸的结合，使寡核苷酸片段两端的荧光供体基团与荧光受体基团相互接近，发生荧光能量共振转移，使供体荧光基团的激发光产生受体荧光基团的发射光。
本发明的具体步骤如下第一步，用各种化学或物理方法将streptavidin固定于玻片表面。
第二步，化学合成寡核苷酸片段。这种片段的序列特征是5’-末端的序列将与待测核酸样品目标区域的3’-序列配对，3’-末端的序列将与目标区域的5’-序列配对，中间序列是寡聚胸腺核苷酸；这种片段的修饰特征是两个末端分别用不同的荧光基团修饰，中间用生物素修饰。生物素的作用是将寡核苷酸固定于玻片表面；两个荧光基团用于产生检测信号，其信号产生原理基于两个荧光基团在相互作用接近时将发生荧光能量共振转移。
第三步，修饰过的寡核苷酸片段微点阵化固定于用streptavidin包被的玻片表面。Streptavidin与生物素之间存在接近共价键强度的相互作用力，因此借助这一相互作用力使寡核苷酸片段固定于玻片表面，制备荧光共振能量转移类寡核苷酸基因芯片。
本发明的荧光供体基团是Fluorescein，荧光受体基团是Red640，利用生物素与streptavidin间相互作用固定探针分子在玻片上。如果不存在荧光能量共振转移(即没有相应的目标核酸存在)，用490nm波长激发，只有Fluorescein发出荧光，其发射光波长是518nm。如果存在荧光能量共振转移(即有相应的目标核酸存在)，用490nm波长激发，Fluorescein的发射光进一步激发Red640，后者发射光的波长是640nm。在寡核苷酸基因芯片检测过程中，激发光波长是490nm，在640nm波长处检测荧光信号强度。这种设计和检测原则也可以是其它类型的荧光共振能量转移，如荧光供体基团是Fluorescein，荧光受体基团是Cy5等，但相应地需要调整检测系统的滤光系统。寡核苷酸片段中间的生物素基团用于寡核苷酸片段在streptavidin包被玻片表面的固定。也可以采用其它技术将寡核苷酸片段固定于玻片或其它基片表面。一张基因芯片上可以固定多种寡核苷酸片段，用于检测不同种类的核酸分子。
本发明与现有的基因芯片技术相比有显著的进步。主要优点如下(1)待测样品无需预先用荧光基团标记；(2)能够检测出待测核酸一个位点的核苷酸差异；(3)探针分子没有茎环结构，因此与目标核酸杂交时没有能量障碍，检测的灵敏度高；(4)目标分子可以是DNA、RNA、单链核酸、双链核酸。因此可以提高检测通量。
采用本发明制备的基因芯片可用于检测待测核酸的种类与含量，单核苷酸多态性分析以及疾病诊断等领域。
本实施例为检测镰刀型贫血症的寡核苷酸片段，荧光供体基团是Fluorescein，荧光受体基团是Red640，利用生物素与streptavidin间相互作用固定探针分子在玻片上。一、玻片的包被用去离子水清洗玻片，去除表面杂质。用EDC或NHS与玻片表面的活性羟基反应，将玻片表面变成活泼酯。将streptavidin溶解于TE缓冲液中，将玻片浸在streptavidin溶液中，37℃反应1小时。反应结束后，用SSC缓冲液洗涤玻片3次，每次洗涤5分钟，除去非特异性吸附的杂质分子。用去离子水洗涤玻片两次，在平板离心机上2000rpm转速下离心2分钟，玻片置于干净容器内备用。二、寡核苷酸片段的合成利用DNA序列合成仪合成特殊基团修饰的寡核苷酸探针片段，探针分子的5’端用荧光供体基团Fluorescein进行标记，3’端用荧光受体集团Red640进行标记，探针中间的oligodT序列正当中的胸腺嘧啶T用生物素(biotin)进行标记。本实施例中的探针序列为FT5’(Fd)GTCTGAAGTGGAGTCCTC(T15-Tbiotin-T15)GGGGTGTCCCGTCATTG(Fa)3’FA5’(Fd)GTCTGAAGAGGAGTCCTC(T15-Tbiotin-T15)GGGGTGTCCCGTCATTG(Fa)3’FC5’(Fd)GTCTGAAGCGGAGTCCTC(T15-Tbiotin-T15)GGGGTGTCCCGTCATTG(Fa)3’FG5’(Fd)GTCTGAAGGGGAGTCCTC(T15-Tbiotin-T15)GGGGTGTCCCGTCATTG(Fa)3’CX5’(Fd)GTCCATAGTGTCTCTACGT(T15-Tbiotin-T15)GGGAGTCGTAGAAAGAAG(Fa)3’Fd为荧光供体，Fa为荧光受体，Tbiotin为生物素标记的胸腺嘧啶，斜体碱基与待测核酸杂交配对，带下划线的碱基为被检测的突变碱基。FT片段与镰刀型贫血症基因序列配对，FA、FC、FG分别与血红蛋白HbAβ链基因中73位的其它三种突变碱基A、C、G配对。寡核苷酸CX能够与X染色体DNA配对，用作对照。合成步骤如下1.Stepl对在CPG担体上附加的第一个碱基进行脱保护(DMTr基)反应，用以准备附加下一个新的碱基。
2.Step2活化新的碱基，准备和前一个碱基进行反应。
3.Step3第二个碱基附加反应到第一个碱基上。
4.Step4把第一个碱基没有和第二个碱基反应上的部分(反应失败部分)加帽封死(Capping反应)，不让其进行进一步延伸反应。
5.Step5对第二个碱基和第一个碱基的连接部分进行氧化反应，使3价磷变成5价磷，使合成产物变得更加稳定。
6.如需进一步合成延伸碱基时，再回到Stepl进行合成。如此循环往复，可以不断合成DNA碱基，直至合成完所需序列。
7.DNA合成结束后，从CPG担体上用氨水解离合成终了的Oligo DNA。
在固相合成中，当合成第33个碱基——生物素标记的T时，加入的T应为生物素标记的T。固相合成完成后，对合成的oligo DNA进行5’端Fluorescein标记与3’端Red640标记。至此特殊基团修饰的寡核苷酸探针片段合成完毕。三、寡核苷酸片段微阵化固定于streptavidin包被的玻片上利用自动化芯片点样仪将寡核苷酸片段点阵排布于streptavidin包被的玻片上，借助于Streptavidin与生物素之间的相互作用力将寡核苷酸片段固定于玻片上，制备高密度基因芯片。若寡核苷酸片段种类很少，也可采用人工点样将寡核苷酸片段固定于玻片上。用SSD缓冲液洗涤玻片3次，每次洗涤5分钟，除去非特异性吸附的杂质分子。用去离子水洗涤玻片两次，在平板离心机上2000rpm转速下离心2分钟。至此检测镰刀型贫血症的荧光共振能量转移类寡核苷酸基因芯片制备完成，可用于检测镰刀型贫血症。
权利要求
1.一种荧光共振能量转移类寡核苷酸基因芯片制备方法，其特征在于将寡核苷酸片段两端预先用相应的荧光基团标记，一个是荧光供体基团，另一个是荧光受体基团，片段的中间用生物素标记，荧光标记的寡核苷酸片段以微点阵的形式固定于streptavidin包被的玻片表面，具体步骤如下第一步，将streptavidin固定于玻片表面；第二步，化学合成寡核苷酸片段，这种片段的序列特征是5’-末端的序列将与目标区域的3’-序列配对，3’-末端的序列将与目标区域的5’-序列配对，中间序列是寡聚胸腺核苷酸，这种片段的修饰特征是两个末端分别用不同的荧光基团修饰，中间用生物素修饰；第三步，修饰过的寡核苷酸片段微点阵化固定于用streptavidin包被的玻片表面，制备荧光共振能量转移类寡核苷酸基因芯片。
2.如权利要求1所说的一种荧光共振能量转移类寡核苷酸基因芯片制备方法，其特征在于荧光供体基团是Fluorescein，荧光受体基团是Red640或Cy5。
全文摘要
本发明涉及一种荧光共振能量转移类寡核苷酸基因芯片制备方法,采用将寡核苷酸片段两端分别用不同的荧光基团进行标记,中间用生物素标记的方法,将标记的寡核苷酸片段以微点阵列的形式固定于streptavidin包被的玻片表面,从而制备荧光共振能量转移类基因芯片。本发明制备的基因芯片可用于检测待测核酸的种类与含量,单核苷酸多态性分析以及疾病诊断等领域,待测样品无需预先用荧光标记,由于探针分子没有茎环结构,因此与目标核酸杂交时没有能量障碍,检测的灵敏度高,目标分子可以是DNA、RNA、单链核酸、双链核酸,因此可以提高检测通量。
文档编号C12Q1/68GK1360058SQ0113925
公开日2002年7月24日 申请日期2001年12月27日 优先权日2001年12月27日
发明者刘喜朋, 刘建华, 陈洁, 林志新 申请人:上海交通大学