专利名称：基于荧光共振能量转移对水溶液中汞离子和/或银离子同时进行检测的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于荧光共振能量转移检测水溶液中二价汞离子和银离子的方法，属重金属离子的检测技术领域。
背景技术：
重金属离子如汞离子和/或银离子是严重的环境污染物。它们污染水和土壤，对人类健康造成严重威胁并且对动植物产生严重的毒性效应。汞离子在环境中存在富集作用而且长期的与之接触能够导致中枢神经系统持久且严重的损坏。银离子已经被证明对水生生物有强烈的毒性。因此，发明一种能够有效而灵敏的检测这两种离子的方法是非常重要的。传统的检测方法如冷原子荧光光谱法(CV-AFS)，冷原子吸收光谱法(CV-AAS)，电感耦合等离子体质谱(ICPMS)等有很多缺陷工作量大、成本高而且过程复杂。为了解决传统检测方法带来的问题，发展新的传感器就非常有必要。荧光共振能量转移(FRET)是首先由 Theodor F5rster在50多年前提出的一种物理现象。FRET有多种应用，如已经得到发展的 FRET成像技术和单分子FRET检测技术。近年来，FRET被应用到许多荧光物质的检测中，如检测DNA、溶菌酶、柠檬黄和组胺。众所周知，二价汞离子能够特异性键合胸腺嘧啶碱基T而形成T-Hg2+-T复合物，银离子能够特异性键合胞嘧啶碱基C而形成C-Ag+-C复合物。迄今为止，科学家们已经基于汞离子和银离子这种特殊的性质发展了许多FRET传感器。但是这些传感器主要集中于一种离子的检测，未能做到同时检测这两种离子。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于荧光共振能量转移来同时检测水溶液中二价汞离子和银离子的方法。本发明的技术方案一种基于荧光共振能量转移来同时检测水溶液中二价汞离子和银离子的方法
(一)检测探针的制备
(1)巯基丙酸MPA包裹的碲化镉CdTe量子点的制备
将硼氢化钠NaBH4、超纯水与碲Te粉一起混合在反应容器中，使NaBH4的浓度为2-3M， Te粉含量为0. 5-0. 6M，再将反应容器置于0°C冰水浴中反应12h以制备澄清的NaHTe溶液备用；称取一定量的无机镉盐Cd2+溶解于水中，控制Cd2+浓度为0. 01-0. 02M，在剧烈的搅拌下滴加适量的MPA，用NaOH溶液调节pH为11. 20，通N2除氧、保护30min后迅速加入 NaHTe溶液，维持Cd2+:Te2_: MPA的摩尔比为I: 0. 4-0. 5: 2. 2-2. 5 ;反应后即得到CdTe量子点的前驱体溶液；取前驱体溶液加到以聚四氟乙烯作内衬的不锈钢反应釜中，160°C下反应20min，即得到所需要的CdTe量子点；
(2)检测用的核酸探针的设计与合成
氨基修饰过的单链核酸探针DNAl: 5’-NH2-GTACAAGATG-3’ ；未作任何修饰的单链核酸探针DNA2: 5’ -GAGCTTTTCA GACGCATCTT GTACGACTCG CTCCCCATAC-3’ ；
荧光染料TAMRA修饰过的单链核酸探针TAMRA-DNA: 5’-TAMRA-TTTTGCTC-3’ ；
吲哚类菁染料Cy5修饰过的单链核酸探针Cy5-DNA: 5’-Cy5-GTATCCCC_3’ ；
(3)量子点与核酸的荧光探针CdTe-DNA的制备
首先制备CdTe与DNAl的耦联物把1_乙基_3_ (3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺EDC， N-羟基琥珀酰亚胺NHS与CdTe溶液按适当的比例混合到一起，活化0. 5-1 h，然后加入 DNAl水溶液，在25°C下反应4h，进行超滤以彻底去除未与CdTe耦联的DNA1，即制备得到 CdTe -DNAl ;然后，把CdTe -DNAl与DNA2在室温下进行杂交反应6h，超滤以去除未杂交的 DNA2,即制备得到量子点与DNA的探针CdTe -DNA1-DNA2 ;最后，把Cy5_DNA与TAMRA-DNA 的水溶液分别加到上述制备的CdTe -DNA1-DNA2中，即制备得到检测用的CdTe-DNA荧光探针；
(二)重金属离子Ag+和Hg2+的检测
(1)Ag+的检测
银离子与3-(N-吗啉)丙烷磺酸MOPS之间的键合力很弱，所以选择MOPS缓冲液作为检测体系IOOnM步骤(一)中制备的CdTe -DNA荧光探针，IOmM磷酸二氢钠/磷酸氢二钠 NaH2P04/Na2HP04、20mM 的 M0PS、50mM 的硝酸钠 NaNO3 ；
将含有0-50 nM不同浓度银离子的水溶液加入到上述检测体系中，并在25°C下维持 0. 5h，使Ag+诱导的Cy5-DNA与DNA2杂交反应完全进行，然后测得整个体系的荧光发射图谱；
(2)Hg2+的检测
检测方法与步骤(I)类似，只是将步骤(I)中Ag+离子溶液换成Hg2+溶液；含有0-50 nM 不同浓度Hg2+离子的水溶液加入到上述检测体系中，并在25°C下维持0. 5h，使Hg2+诱导的 TAMRA-DNA与DNA2杂交反应完全进行，然后测量整个体系的荧光发射图谱；
(3)同时进行Ag+和Hg2+的检测
检测方法与步骤(I)类似，只是将步骤(I)中Ag+离子溶液换成Ag+和Hg2+的混合溶液；含有0-50 nM不同浓度Ag+和Hg2+的水溶液加入到上述检测体系中，并在25°C下维持 0. 5h，使Hg2+诱导的TAMRA-DNA与DNA2杂交反应和Ag+诱导的Cy5_DNA与DNA2杂交反应完全进行，然后测量整个体系的荧光发射图谱。所述的一种基于荧光共振能量转移来同时检测水溶液中二价汞离子和银离子的方法量子点与核酸的荧光探针CdTe-DNA的制备首先是制备CdTe与DNAl的耦联物把 320 u L 0. ImM的I-乙基_3_ (3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺EDC，200 y L 0.0125 mM的 N-羟基琥珀酰亚胺NHS与1280 uL IuM CdTe溶液混合到一起，活化0. 5-1 h ;然后加入 IOOuL IOuM的DNAl水溶液，在25°C下反应4小时；然后用超滤膜以5000rpm进行超滤 15min，并用超纯水重悬，再次超滤，如此循环3次，彻底去除未与CdTe耦联的DNA1，即制备得到 CdTe -DNAl ；
然后，把900 ii L I ii M的CdTe-DNAl与100 y L 20 u M DNA2在室温下进行杂交反应6h， 进行同样的超滤步骤去除未杂交的DNA2，即制备得到CdTe-DNAI-DNA2 ；
最后,把100 ii L 20 u M Cy5-DNA与100 y L 20 u M TAMRA-DNA的水溶液分别加到上述制备的CdTe-DNAI-DNA2中，即制备得到检测用的CdTe-DNA荧光探针。本发明的有益效果本发明提供一种基于荧光共振能量转移来同时检测水溶液中二价汞离子和银离子的方法，本发明能做到同时检测这两种离子，相对而言工作量小、成本不高而且过程不复杂。
图I本发明同时检测水溶液中二价汞离子和银离子的流程示意图，其中，Ag+和 Hg2+同时存在时，量子点的能量转移给对应的染料，发生荧光共振能量转移。图2本发明所合成巯基丙酸包裹的CdTe量子点的透射电镜照片。图3本发明所采用的I、CdTe量子点，2、TAMRA，3、Cy5的紫外吸收图谱(实线)和荧光发射图谱(虚线)，其中，激发光的波长选择380纳米。图4本发明实施例I检测Ag+的荧光发射图谱，其中，曲线a至f表示溶液中的Ag+ 分别为0、5、10、15、20、50nM，激发光的波长选择380纳米。图5本发明实施例2检测Hg2+的荧光发射图谱，其中，曲线a至f表示溶液中的 Hg2+分别为0、5、10、15、20、50nM，激发光的波长选择380纳米。图6本发明实施例3检测Ag+和Hg2+的荧光发射图谱，其中，激发光的波长选择 380纳米。
具体实施例方式实施例I
(I)巯基丙酸MPA包裹的CdTe量子点的制备
将0. 189g (5mmol)的硼氢化钠NaBH4溶解在含2. OmL超纯水的玻璃小瓶中，加入 0. 1528g(l. 175mmol)碲Te粉，在瓶盖上留一个小孔，再将反应容器置于0°C冰水浴中反应。 12h后，黑色的Te粉消失，得到澄清的NaHTe溶液备用。称取0. 57g(2. 5mmol)CdCl2*2. 5H20 溶解在150mL水中，在剧烈的搅拌下滴加500ML (5. 74mmol)的MPA，用0. lmol/L的NaOH溶液调节pH为11. 20，通队除氧、保护30min后迅速加入上述制备好的NaHTe溶液，反应后即得到CdTe量子点的前驱体溶液。取40mL前驱体溶液加到以聚四氟乙烯作内衬的不锈钢反应釜中，160°C下反应20分钟，即得到所需要的CdTe量子点。(2)检测用的核酸探针的设计与合成
选择2种染料作为能量的受体，这2种染料分别修饰在相应核酸探针的5’端；另一条核酸探针的5’端修饰氨基是为了能够与表面修饰有羧基的量子点进行共价耦联；此外，还有一条为未作修饰的核酸探针，作为连接能量供体量子点和能量受体染料的桥梁。所有核酸探针均由上海生工生物工程有限公司合成，其具体序列如下
氨基修饰过的单链核酸探针DNAl: 5’ -NH2-GTACAAGATG-3’ ;
未作任何修饰的单链核酸探针DNA2: 5’ -GAGCTTTTCA GACGCATCTT GTACGACTCG CTCCCCATAC-3’ ;
荧光染料TAMRA修饰过的单链核酸探针TAMRA-DNA: 5’-TAMRA-TTTTGCTC-3’ ；
吲哚类菁染料Cy5修饰过的单链核酸探针Cy5-DNA: 5’-Cy5-GTATCCCC_3’ ；
(3)制备量子点与核酸的荧光探针(CdTe-DNA)
6首先是制备CdTe与DNAl的耦联物把320 ii L 0. ImM的I-乙基_3_ (3-二甲氨基丙基)_碳化二亚胺(EDC)，200ii L 0.0125 mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与1280 y L IuM CdTe溶液混合到一起，活化0.5-1 h。然后加入IOOii L 10 y M的DNAl水溶液，在25°C下反应4小时。然后用超滤膜以5000rpm进行超滤15min,并用超纯水重悬,再次超滤,如此循环3次，彻底去除未与CdTe耦联的DNAl。这样即制备得到CdTe -DNAl0接下来，把900 ii L浓度为Iii M的CdTe-DNAl与IOOii L 20 u M DNA2在室温下进行杂交反应6h。进行同样的超滤步骤去除未杂交的DNA2。这样即制备得到CdTe-DNAI-DNA2。最后，把IOOu L 20 u M Cy5-DNA % 100 u L 20 u M TAMRA-DNA 的水溶液分别加到上述制备的CdTe-DNAI-DNA2中。这样即制备得到检测用的CdTe-DNA荧光探针。(4) Ag+ 的检测
因为银离子与3-(N-吗啉)丙烷磺酸(MOPS)之间的键合力很弱，所以选择MOPS缓冲液作为检测体系=IOOnM步骤(一)制备的CdTe -DNA荧光探针，IOmM磷酸二氢钠/磷酸氢二钠 NaH2P04/Na2HP04、20mM 的 M0PS、50mM 的硝酸钠 NaNO3。含有不同浓度(0到50 nM)银离子的水溶液加入到上述检测体系中，并在25°C下维持0. 5h，使银离子诱导的Cy5-DNA与DNA2杂交反应完全进行。然后测量整个体系的荧光发射图谱。实施例2
(I)巯基丙酸MPA包裹的CdTe量子点的制备。方法如实例I所述。(2)检测用的核酸探针的设计与合成方法如实例I所述。(3)制备量子点与核酸的荧光探针(CdTe-DNA)
方法如实例I所述。(4) Hg2+ 的检测
检测体系如实例I所述，含有不同浓度(0到50 nM) Hg2+离子的水溶液加入到上述检测体系中，并在25°C下维持0. 5h，使Hg2+诱导的TAMRA-DNA与DNA2杂交反应完全进行。然后测量整个体系的荧光发射图谱。实施例3
(I)巯基丙酸MPA包裹的CdTe量子点的制备。方法如实例I所述。(2)检测用的核酸探针的设计与合成方法如实例I所述。(3)制备量子点与核酸的荧光探针(CdTe-DNA)
方法如实例I所述。(4)同时进行Ag+和Hg2+的检测
检测体系如实例I所述，含有不同浓度(0到50 nM)Ag+和Hg2+的水溶液加入到上述检测体系中，并在25°C下维持0. 5h，使Hg2+诱导的TAMRA-DNA与DNA2杂交反应和Ag+诱导的Cy5-DNA与DNA2杂交反应完全进行。然后测量整个体系的荧光发射图谱。
权利要求
1.一种基于荧光共振能量转移来同时检测水溶液中二价汞离子和银离子的方法，其特征在于(一)检测探针的制备(1)巯基丙酸MPA包裹的碲化镉CdTe量子点的制备将硼氢化钠NaBH4、超纯水与碲Te粉一起混合在反应容器中，使NaBH4的浓度为2-3M， Te粉含量为O. 5-0. 6M，再将反应容器置于0°C冰水浴中反应12h以制备澄清的NaHTe溶液备用；称取一定量的无机镉盐Cd2+溶解于水中，控制Cd2+浓度为O. 01-0. 02M，在剧烈的搅拌下滴加适量的MPA，用NaOH溶液调节pH为11. 20，通N2除氧、保护30min后迅速加入 NaHTe溶液，维持Cd2+:Te2_: MPA的摩尔比为I: O. 4-0. 5: 2. 2-2. 5 ;反应后即得到CdTe量子点的前驱体溶液；取前驱体溶液加到以聚四氟乙烯作内衬的不锈钢反应釜中，160°C下反应20min，即得到所需要的CdTe量子点；(2)检测用的核酸探针的设计与合成氨基修饰过的单链核酸探针DNAl: 5’-NH2-GTACAAGATG-3’ ；未作任何修饰的单链核酸探针DNA2: 5’ -GAGCTTTTCA GACGCATCTT GTACGACTCG CTCCCCATAC-3’ ；荧光染料TAMRA修饰过的单链核酸探针TAMRA-DNA: 5’-TAMRA-TTTTGCTC-3’ ；吲哚类菁染料Cy5修饰过的单链核酸探针Cy5-DNA: 5’-Cy5-GTATCCCC_3’ ；(3)量子点与核酸的荧光探针CdTe-DNA的制备首先制备CdTe与DNAl的耦联物把1_乙基_3_ (3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺EDC， N-羟基琥珀酰亚胺NHS与CdTe溶液按适当的比例混合到一起，活化O. 5-1 h，然后加入 DNAl水溶液，在25°C下反应4h，进行超滤以彻底去除未与CdTe耦联的DNA1，即制备得到 CdTe -DNAl ;然后，把CdTe -DNAl与DNA2在室温下进行杂交反应6h，超滤以去除未杂交的 DNA2,即制备得到量子点与DNA的探针CdTe -DNA1-DNA2 ;最后，把Cy5_DNA与TAMRA-DNA 的水溶液分别加到上述制备的CdTe -DNA1-DNA2中，即制备得到检测用的CdTe-DNA荧光探针；(二)重金属离子Ag+和/或Hg2+的检测(I)Ag+的检测银离子与3-(N-吗啉)丙烷磺酸MOPS之间的键合力很弱，所以选择MOPS缓冲液作为检测体系IOOnM步骤(一)中制备的CdTe -DNA荧光探针，IOmM磷酸二氢钠/磷酸氢二钠 NaH2P04/Na2HP04、20mM 的 M0PS、50mM 的硝酸钠 NaNO3 ；将含有0-50 nM不同浓度银离子的水溶液加入到上述检测体系中，并在25°C下维持O.5h，使Ag+诱导的Cy5-DNA与DNA2杂交反应完全进行，然后测得整个体系的荧光发射图(2)Hg2+的检测检测方法与步骤(I)类似，只是将步骤(I)中Ag+离子溶液换成Hg2+溶液；含有0-50 nM 不同浓度Hg2+离子的水溶液加入到上述检测体系中，并在25°C下维持O. 5h，使Hg2+诱导的 TAMRA-DNA与DNA2杂交反应完全进行，然后测量整个体系的荧光发射图谱；(3)同时进行Ag+和Hg2+的检测检测方法与步骤(I)类似，只是将步骤(I)中Ag+离子溶液换成Ag+和Hg2+的混合溶液；含有0-50 nM不同浓度Ag+和Hg2+的水溶液加入到上述检测体系中，并在25°C下维持O.5h，使Hg2+诱导的TAMRA-DNA与DNA2杂交反应和Ag+诱导的Cy5_DNA与DNA2杂交反应完全进行，然后测量整个体系的荧光发射图谱。
2.根据权利要求I所述的一种基于荧光共振能量转移来同时检测水溶液中二价汞离子和银离子的方法，其特征在于量子点与核酸的荧光探针CdTe-DNA的制备首先是制备 CdTe与DNAl的耦联物把320 μ L O. ImM的I-乙基_3_ (3- 二甲氨基丙基)-碳化二亚胺 EDC, 200 μ L O. 0125 mM的N-羟基琥珀酰亚胺NHS与1280 μ L ΙμΜ CdTe溶液混合到一起， 活化O.5-1 h;然后加入IOOyL 10 μ M的DNAl水溶液,在25°C下反应4小时；然后用超滤膜以5000rpm进行超滤15min，并用超纯水重悬，再次超滤，如此循环3次，彻底去除未与 CdTe耦联的DNAl，即制备得到CdTe -DNAl ；然后，把900 μ L I μ M的CdTe-DNAl与100 μ L 20 μ M DNA2在室温下进行杂交反应6h， 进行同样的超滤步骤去除未杂交的DNA2，即制备得到CdTe-DNAI-DNA2 ；最后,把100 μ L 20 μ M Cy5-DNA与100 μ L 20 μ M TAMRA-DNA的水溶液分别加到上述制备的CdTe-DNAI-DNA2中，即制备得到检测用的CdTe-DNA荧光探针。
全文摘要
一种基于荧光共振能量转移来同时检测水溶液中二价汞离子和银离子的方法，属重金属离子的检测技术领域。本发明步骤为(一)检测探针的制备包括(1)巯基丙酸MPA包裹的碲化镉CdTe量子点的制备；(2)检测用的核酸探针的设计与合成；(3)量子点与核酸的荧光探针CdTe-DNA的制备；(二)重金属离子Ag+和/或Hg2+的检测。本发明能做到同时检测这两种离子，相对而言工作量小、成本不高而且过程不复杂。
文档编号G01N21/64GK102590170SQ20121004711
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者严文静, 徐丽广, 胥传来, 许宙, 赵媛, 郝昌龙 申请人:江南大学